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在您看到熒光定量PCR結(jié)果的時候是否也有過這樣的疑問？隱隱約約感覺實驗某個步驟出現(xiàn)問題，卻又不知該從何下手。別擔心，有“對照精靈”們來助您一臂之力。

熒光定量PCR實驗，從樣本采集到結(jié)果分析包含多個實驗步驟，針對不同的步驟，可以選擇不同的對照對流程進行監(jiān)控（圖1）。

圖1. 實驗流程和常見陰陽性對照種類。

陰性樣本指不含有目的基因或者靶序列的樣本，也可以是樣本保存液。從核酸提取開始做起，經(jīng)歷提取、逆轉(zhuǎn)錄（如有）和擴增過程。如果出現(xiàn)擴增，則說明其中某一實驗步驟中存在污染，結(jié)合NTC結(jié)果，可以判斷是否是樣本提取過程中引入的污染。

可使用含有擴增片段的質(zhì)粒、假病毒或者基因組DNA/cDNA作為擴增陽性對照，監(jiān)控熒光定量PCR的體系是否正常，包括酶、引物、探針等。如果檢測中包含多個目標片段，可以將這些目標片段都克隆到同一個質(zhì)粒中，方便制備和使用。當擴增對照沒有擴增，或者Ct值大于預期，則說明定量PCR體系存在問題。

表1：陽性內(nèi)對照和相關(guān)試劑盒

圖2：通過IPC提示體系中抑制劑的存在。實驗結(jié)果為同樣濃度的RNA加入相同拷貝Xeno IPC，在不同濃度的擴增抑制劑血紅素存在下（0-4μM），Xeno IPC的Ct值與目標RNA的Ct值定量結(jié)果。

上面提到的陽性對照能夠為實驗流程提供很多質(zhì)控信息。對于樣本本身的質(zhì)量，比如拭子是否刮取到樣本、RNA在運輸和保存過程中是否有嚴重的降解等問題，則可以通過對內(nèi)參基因的定量來幫助回答。

內(nèi)參基因一般選擇在取樣組織或細胞中均有足量表達的基因，且其表達量不受環(huán)境、實驗處理條件和取樣時間等因素影響， 如管家基因（housekeeping gene）。常用人類內(nèi)參基因如表2所示。要注意沒有某個內(nèi)參基因是萬能的，需要根據(jù)樣本類型和實驗處理方式進行評估和選擇（可參考Application Note: Using TaqMan Endogenous Control Assays to select an endogenous control）。實驗中通過內(nèi)參基因的Ct值來判斷取樣和樣本降解情況。在相對定量實驗中，內(nèi)參基因亦可用于對取樣量進行均一化。

如果進行的是單管多重實驗，還需考慮內(nèi)參基因的表達量。當內(nèi)參基因表達量遠高于目的基因時，內(nèi)參基因?qū)?yōu)勢擴增，體系中的原料消耗速度過快，造成目的基因擴增效率降低。此時可以選擇引物濃度降低的TaqMan試劑盒（Primer-Limited）對內(nèi)參基因進行測定。

表2：常用人類內(nèi)參基因試劑盒（cDNA）

對于核酸提取儀、實驗臺面、超凈臺等可在實驗結(jié)束后用70%的乙醇或者10%的次氯酸鈉（具腐蝕性，建議使用前咨詢設備供應商）擦拭或者利用紫外線照射5-20分鐘進行表面清潔。如果需要對殘留的核酸進行更*的清潔， DNAZap™ PCR DNA Degradation Solutions能更有針對性地降解儀器和臺面上殘留的DNA和RNA。