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細胞瀕臨死亡時，其細胞膜中的磷脂分子結構會發生紊亂，進而促進磷脂酰絲氨酸的暴露，這是胞吐作用的關鍵過程。此前研究發現Xkr家族蛋白Xkr4對于磷脂分子結構的紊亂具有關鍵的作用，但其激活機制仍然未知。在最近一項研究中，來自日本京都大學的Jun Suzuki教授等人揭示了Xkr4被激活的兩個步驟：caspase介導的切割形成的二聚體，以及激活因子引起的結構變化。為了確定參與該過程的關鍵因素，作者使用CRISPR sgRNA文庫開發了一種新的篩選系統，即“存活篩選”。應用該系統，作者確定了核蛋白XRCC4是激活Xkr4的關鍵分子。當細胞凋亡發生后，DNA修復復合體中所含的XRCC4蛋白被caspase裂解，其C末端片段被釋放到細胞質中，之后該片段與Xkr4二聚體相互作用并導致后者的激活。
此前研究發現，細胞凋亡過程中caspase介導的C-末端切割會導致Xkr4蛋白的激活，而切割反應本身并不會導致磷脂酰絲氨酸分子的暴露。為了解釋C末端切割與Xkr4活性之間的關系，作者首先進行了細胞學水平的篩選。結果表明，在表達全長的Xkr4分子以及caspaseC末端的細胞中，外界刺激會導致脂質結構的紊亂，而該過程依賴于caspase的活性，表明Xkr4的活性不僅依賴caspase本身的切割，同時還需要caspase的其它活性。此外，生化分析表明Xkr4與C末端肽段的二聚化不足以激活其活性。進一步，作者通過高通量突變的技術，篩選得到了若干株能夠穩定出現磷脂膜結構紊亂的細胞克隆，上述克隆中Xkr4分子發生了一系列突變，導致其活性能夠持續保持。
（cDNA文庫篩選揭示Xkr4突變對磷脂膜結構的影響）
之后，作者對具備上述活性的Xkr4突變體進行了測序分析，發現了其中存在特定的單點突變，包括I322S, L331F, 或者Q332E。通過分別轉染上述突變蛋白并進行功能學與結構學方面的分析，作者發現Xkr4的激活依賴兩個獨立的事件：二聚化以及結構變化。
（圖2，Xkr4突變株功能分析及其對磷脂膜結構的影響）
進一步，作者試圖探究在自然條件下Xkr4激活的原因。通過高通量的CRISPR-cas9突變篩選，作者發現了一種叫做XRCC4的蛋白，此前研究表明XRCC4是DNA損傷修復復合體的成分，而該研究表明XRCC4蛋白的缺失會顯著影響Xkr4蛋白破壞磷脂膜結構的活性。在此基礎上，作者發現XRCC4受caspase3的切割而被激活，切割后的XRCC4的C末端能夠從細胞核向細胞膜部位轉移。在外界促凋亡刺激下，XRCC4能夠調節Xkr4的活性，進而促進磷脂膜的紊亂與磷脂酰絲氨酸的暴露。
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