MB50246.3 v.A

   細菌P型ATP酶（P type ATPase）活性酶連續反應光度法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

   細菌P型ATP酶（P type ATPase）活性酶連續反應光度法定量檢測試劑是一種旨在使用P型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，在釩酸鹽存在與否的情況下，受到P型ATP酶的水解產生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細菌細胞P型ATP酶的特異性活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

腺苷三磷酸酶，又稱為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。ATP酶的去磷酸化反應釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進出細胞。根據ATP酶的結構和功能，分為五類不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型ATP酶，又稱為E1-E2 ATP酶，通常由一條或兩條多肽構成，且呈現兩種主要的結構構象E1和E2。這類ATP酶存在于細菌和真核細胞膜和細胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運輸各種化學分子，包括離子和磷脂，例如H⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺等。P型ATP酶可以分成三型：I型（細菌重金屬離子型）、II型（動物Na/K、H/K、SERCA、PMCA、真菌和植物HA）、III型（細菌K）和四種，Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細菌型等。 基于ATP，在P型ATP酶抑制劑釩酸鹽（vanadate）存在與否的情況下，受到P型ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析P型ATP酶的特異活性。其反應系統為：

產品內容

   裂解液（Reagent A）   毫升

   緩沖液（Reagent B）      毫升

   酶促液（Reagent C）           微升

   反應液A（Reagent D1）      毫升

   反應液B（Reagent D2）      毫升

   底物液（Reagent E） 毫升

   陰性液（Reagent F）   毫升

   專性液（Reagent G）   毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存   反應液B（Reagent D2）在4℃冰箱，其余的在－20℃冰箱里，避免反復凍融；   底物液（Reagent E），避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備

培養箱：用于反應孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；   底物液（Reagent E）注意避光。然后進行下列操作。

• 樣品準備（總蛋白制備）

• 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
• 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升   裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里30分鐘，期間強力渦旋震蕩15秒三次
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g 
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1；使用   裂解液（Reagent A）作為陰性對照）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

• 準備好待測樣品，置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數7次（共30分鐘），并置零
•    緩沖液（Reagent B）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   反應液A（Reagent D1）
• 加入xx微升   反應液B（Reagent D2）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進37℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升   陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數30分鐘

四、樣品總活性測定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   反應液A（Reagent D1）
• 加入xx微升   反應液B（Reagent D2）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進37℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數30分鐘

五、樣品非特異活性測定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   專性液（Reagent G）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進37℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數30分鐘

• 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項

• 本產品為21次操作（10個樣本），包括背景對照測定
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用質膜樣品為佳（   細菌可溶性膜蛋白制備試劑盒—GMS30022.2）
• 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等
• 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光度測定
• 反應測定值由高到低變化；測定可以持續30分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于10分鐘或30分鐘測定讀數，表明有酶活性
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 樣品特異活性是指釩酸鹽敏感的P型ATP酶
• P型ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類分析技術產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確