治療性單克隆抗體結(jié)構(gòu)相對(duì)小分子更加復(fù)雜。不僅僅是序列影響蛋白活性，同時(shí)蛋白的翻譯化修飾也會(huì)影響。常見的修飾包括脫酰胺、二硫鍵、末端賴氨酸丟失和糖基化修飾，糖基化修飾是相對(duì)復(fù)雜的特殊翻譯后修飾，包括N糖修飾和O糖修飾，N糖基化修飾主要發(fā)生在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中的特征性序列NXT(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)，修飾存在一定規(guī)律，O糖修飾可以與任何含有羥基基團(tuán)的氨基酸連接，絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)是常見的修飾位點(diǎn)，因此更加復(fù)雜。糖型結(jié)構(gòu)會(huì)顯著影響治療效果，是單抗藥物質(zhì)量監(jiān)測(cè)的重要關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

抗體生物類似藥在面臨生產(chǎn)和臨床過程中，需要保證質(zhì)量的一致性，糖基化分析是重要的關(guān)鍵分析流程。糖修飾異質(zhì)性會(huì)間接影響藥效，因此需要在多批次生產(chǎn)過程中，保證工藝和質(zhì)量的穩(wěn)定性。N糖根據(jù)不同的連接方式使得N-糖基化的五糖核心結(jié)構(gòu)分為高甘露糖型、雜合型和復(fù)雜型3 種類型，F(xiàn)DA，EMA 等生物類似藥指導(dǎo)原則都鼓勵(lì)研發(fā)單位采用新的分析技術(shù)手段，對(duì)生物類似藥和原研藥的糖基化修飾位點(diǎn)、程度以及寡糖的組成進(jìn)行深入比較分析，例如可以利用島津液相以及質(zhì)譜等設(shè)備可進(jìn)行由淺入深的糖型修飾分析，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中嚴(yán)格監(jiān)測(cè)。島津在糖基化分析方面有三大護(hù)法守護(hù)。下面一一道來。

島津抗體糖型分析質(zhì)控解決方案

第一護(hù)法-高分辨質(zhì)譜

LCMS-9030

LCMS-9030四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀使高速度、高靈敏度的四極桿質(zhì)譜與TOF技術(shù)的緊密結(jié)合。融合島津先進(jìn)工程技藝的DNA，打造出速度與出色性能兼?zhèn)涞娜乱淮叻直尜|(zhì)譜儀，以優(yōu)異表現(xiàn)輕松勝任定性和定量分析挑戰(zhàn)。對(duì)完整蛋白以及亞基水平的糖型進(jìn)行初步分析。

第二護(hù)法-MALDI-MS

MALDImini-1

MALDImini-1數(shù)字離子阱（DIT）體積極小，功能強(qiáng)大，可實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜多級(jí)的檢測(cè)。針對(duì)糖肽分析、抗體化學(xué)修飾位點(diǎn)、未知生物分子結(jié)構(gòu)分析，蛋白質(zhì)、多肽、翻譯后修飾肽等都有專向解決方法。

第三護(hù)法-高效液相色譜系統(tǒng)
 

Nexera Bio

從完整蛋白或者亞基水平分析，利用質(zhì)譜可快速的分析帶有糖基化修飾蛋白分子量。可以分析簡(jiǎn)單的糖型結(jié)構(gòu)，速度比較快，重現(xiàn)性較好，但是精細(xì)的糖型結(jié)構(gòu)也不能很好的監(jiān)測(cè)清楚，所以可以搭配糖肽水平和游離寡糖水平一同研究。

首先，第一步從完整蛋白水平，利用島津LCMS-9030四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀從完整分子量水平分析抗體的糖修飾情況如下表所示，鑒定并分析相關(guān)糖型的分布。

不同糖型抗體形式分子量測(cè)定結(jié)果與理論對(duì)比

第二步可以從糖肽水平分析，通常抗體通過使用蛋白酶酶切后，產(chǎn)生分子量大約為0. 5 ～ 5 kDa 的小肽，采用色譜或電泳分離后再進(jìn)行MALDI-MS 或ESI-MS 分析。利用質(zhì)譜分析糖肽序列、寡糖組成，島津MALDI-TOF和MALDI-數(shù)字離子阱質(zhì)譜可以分析相關(guān)糖肽組成分析。

例如針對(duì)血清糖蛋白，使用MALDI-離子阱質(zhì)譜分析得到的衍生N-聚糖譜圖，如下圖所示：

血清糖蛋白N-聚糖質(zhì)譜解析譜圖

第三步可以從游離寡糖層面分析，藥典相關(guān)要求，針對(duì)游離寡糖的分析通常有三種方法: （第一法）親水相互作用色譜法、（第二法）毛細(xì)管電泳法、（第三法）高效陰離子色譜法，通過N-糖苷酶F對(duì)單抗N糖進(jìn)行酶切后，使用2-氨基苯甲酰胺( 2-AB) 或2-氨基苯甲酸( 2-AA) 對(duì)寡糖進(jìn)行標(biāo)記即可進(jìn)行糖型分析。針對(duì)唾液酸分析，島津超高效液相色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器建立了抗體中唾液酸Neu5Ac 和Neu5Gc 含量測(cè)定，結(jié)果如下圖所示：

唾液酸液相分析定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

單抗糖基化是作為重要的翻譯化修飾，宿主細(xì)胞培養(yǎng)工藝過程會(huì)影響不同的修飾構(gòu)成，島津不僅可以提供糖基化質(zhì)量分析質(zhì)控方案，同時(shí)針對(duì)培養(yǎng)工藝優(yōu)化以及工藝殘留物監(jiān)測(cè)，提供特色的培養(yǎng)監(jiān)測(cè)在線和離線分析解決方案，為了更好地把握產(chǎn)品質(zhì)量，力圖讓產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定和安全。雖然生物類似藥與原研藥批次糖基化修飾結(jié)構(gòu)差異依然存在，但在生物類似藥相似性評(píng)價(jià)和適應(yīng)癥外推的征途上還有許多路要走，島津依舊陪伴左右。