組織β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

  組織β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物PNP-NAG受到β氨基己糖苷酶催化水解后，在堿性環境下，呈現黃色，即采用比色法來測定樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體組織裂解懸液樣品中β氨基己糖苷酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase；EC3.2.1.52）.又稱為N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl--β-D-Glucosaminidase；NAGase）屬于含有20個糖苷水解酶（glycoside hydrolase）家族，也是肽聚糖水解酶，為溶酶體組織器中的酶之一。其功能在于水解N-乙酰-β-D-氨基己糖苷中的末端N-乙酰-β-D-氨基己糖殘基（N-acetyl-D-hexosamine   residues），參與組織內糖蛋白和糖脂的分解代謝，包括蛋白和中性糖脂中的寡糖、粘多糖等水解。具有宿主抗感染防御作用。β氨基己糖苷酶為同源二聚體結構，有α和β兩個亞體構成：HEXA和HEXB。人體缺乏HEXA或HEXB，將導致神經退行性相關的疾病，例如家族黑蒙性*病（Tay-Sachs病）和神經節苷脂貯積病  （Sandhoff 病）。 基于底物4-硝基苯基 N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide；PNP-NAG），在β氨基己糖苷酶的作用下，水解釋放出硝基苯酚（p-nitrophenol）和N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（N-acetyl-β-D-glucosamine；NAG），在堿性環境下，呈現出黃色，在分光光度儀下，產生吸光峰值變化（405nm 波長），來定量分析β氨基己糖苷酶的活性。其反應系統為：

產品內容

  緩沖液（Reagent A）  毫升

  反應液（Reagent B）  毫升

  堿性液（Reagent C）    毫升

  陰性液（Reagent D）    微升

  清理液（Reagent E）  毫升

  裂解液（Reagent F）  毫升

產品說明書     1份

保存方式

保存  反應液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

組織刮脫棒：用于組織脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 準備好75cm²組織培養瓶或100mm組織培養皿的待測培養組織（1至5 X 10⁷組織）
• 小心加入xx毫升  清理液（Reagent E），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用組織刮脫棒輕柔刮脫組織（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升  清理液（Reagent E），混勻組織
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮組織從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升  裂解液（Reagent F），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－   30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如組織裂解萃取懸液樣品等），置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零
•   緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應液（Reagent B）
• 加入xx微升  陰性液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 加入xx微升  堿性液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照

• 樣品測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應液（Reagent B）
• 加入50微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH小于7.5）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 加入xx微升  堿性液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數 

四、計算樣品活性

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到相應孔里
• 分別加入xx微升  反應液（Reagent B）
• 分別加入xx微升  陰性液（Reagent D）或待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH小于7.5）
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 分別加入xx微升  堿性液（Reagent C）
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 即刻放進酶標儀檢測 
• 活性計算

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要
• 建議使用比色皿測定
• 加樣后3秒內比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續10分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定10分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒   30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• β氨基己糖苷酶單位活性定義為：在37℃，pH 4.25條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列組織酶學檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感