胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光(Fura Red)檢測(cè)試劑盒(中文版)
MB10152.2 v.A
胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光(Fura Red)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(中文版)
主要用途
胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光(Fura Red)檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)胞漿鈣離子特異性熒光探針Fura-Red-AM,與鈣離子結(jié)合后,其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),在熒光酶標(biāo)儀下測(cè)量不同激發(fā)波長(zhǎng)下相對(duì)熒光峰值的比值,來(lái)測(cè)定細(xì)胞漿總鈣離子濃度的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞(動(dòng)物、人體等)或冰凍切片組織細(xì)胞漿鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,檢測(cè)敏感。
技術(shù)背景
鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì),占1150克。其中99%的鈣以氟磷灰石鈣(calcium fluorophosphate apatite)形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式:一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣,其構(gòu)成約40%至50%的血清中的總鈣含量;另一種為彌散型游離鈣,其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣(complexed calcium)和離子鈣(ionized calcium)。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性(neuromuscular excitability)、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi),鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中細(xì)胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。細(xì)胞漿鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法(flame photometry)、原子吸收分光光度法等技術(shù),但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾,或者受限于儀器的特殊的要求,以及需要細(xì)胞漿分離。Fura-Red AM(acetoxy-methyl ester),為Fura 2衍生物,一種具有細(xì)胞膜通透性,與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料,通過(guò)其不同激發(fā)波長(zhǎng)420nm/480nm產(chǎn)生的熒光信號(hào)比(散發(fā)波長(zhǎng)550nm)來(lái)*測(cè)定細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子水平。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 毫升
染色液(Reagent B) 微升
介導(dǎo)液(Reagent C) 微升
飽和液(Reagent D) 毫升
陰性液(Reagent E) 毫升
裂解液(Reagent F) 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書 1份
保存方式
保存 染色液(Reagent B)和 介導(dǎo)液(Reagent C)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里;有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管:用于工作液配制的容器
細(xì)胞培養(yǎng)箱:用于染色孵育
黑色96孔板:用于樣品操作的容器
熒光酶標(biāo)儀:用于熒光分析
(共聚焦)熒光顯微鏡:用于熒光染色觀察
實(shí)驗(yàn)步驟
- 測(cè)定準(zhǔn)備
- 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀:激發(fā)波長(zhǎng)420nm和480nm,散發(fā)波長(zhǎng)550nm
- 測(cè)定開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液(Reagent B)室溫下融化,然后分別移出xx微升 介導(dǎo)液(Reagent C)和xx微升 染色液(Reagent B)到新的1.5毫升離心管,標(biāo)記為 染色工作液,并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。
二、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)
- 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板,標(biāo)記為:細(xì)胞樣品孔、空白對(duì)照孔(不含細(xì)胞)、大對(duì)照孔(含細(xì)胞)
- 小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液
- 加入xx微升 清理液(Reagent A)到細(xì)胞樣品孔里
- 加入xx微升 飽和液(Reagent D)到大對(duì)照孔里
- 加入xx微升 陰性液(Reagent E)到空白對(duì)照孔里
- 分別加入10微升 染色工作液到所有孔里
- 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板,混勻
- 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
- 小心抽去細(xì)胞樣品孔里的上清液
- 小心加入xx微升 清理液(Reagent A)到細(xì)胞樣品孔里
- 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9和10一次
- 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
- 加入xx微升 裂解液(Reagent F)到大對(duì)照孔里
- 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘
- 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀:獲得相對(duì)熒光單位(relative fluorescence unit;RFU)包括樣品RFU420nm、樣品RFU480nm、空白對(duì)照孔RFU420nm、空白對(duì)照孔RFU480nm、大對(duì)照孔RFU420nm、大對(duì)照孔RFU480nm
- 計(jì)算樣品細(xì)胞漿鈣離子濃度
三、(共聚焦)或熒光顯微鏡檢測(cè)
1. 準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的細(xì)胞爬片樣品
- 小心加上xx微升 清理液(Reagent A),覆蓋樣品表面
- 小心移去樣品上的 清理液(Reagent A)
- 移取xx微升 清理液(Reagent A)到新的1.5毫升離心管
- 加入xx微升 染色工作液,混勻
- 小心加上上述含有 染色工作液的溶液到樣品上,覆蓋樣品表面
- 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
- 小心移去樣品上的 染色工作液
- 小心加上xx微升新鮮的 清理液(Reagent A)
- 小心移去 清理液(Reagent A)
- 小心加上xx微升新鮮的 清理液(Reagent A)
- 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
- 小心移去 清理液(Reagent A)
- 蓋上蓋玻片
- 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)420至480nm,散發(fā)波長(zhǎng)550nm(細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)紅色熒光)
四、冰凍切片檢測(cè)
- 準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的冰凍切片
- 小心加上xx微升 清理液(Reagent A),覆蓋切片樣品表面
- 小心移去樣品上的 清理液(Reagent A)
- 移取xx微升 清理液(Reagent A)到新的1.5毫升離心管
- 加入xx微升 染色工作液,混勻
- 小心加上上述含有 染色工作液的溶液到切片樣品上,覆蓋樣品表面
- 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
- 小心移去切片上的 染色工作液
- 小心加上xx微升新鮮的 清理液(Reagent A)
- 小心移去 清理液(Reagent A)
- 小心加上xx微升新鮮的 清理液(Reagent A)
- 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
- 小心移去 清理液(Reagent A)
- 蓋上蓋玻片
- 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)420至480nm,散發(fā)波長(zhǎng)550nm(組織細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)紅色熒光)
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為20次(顯微鏡)或60次(96孔板)操作
- 操作時(shí),須戴手套
- 可以使用熒光分光光度儀檢測(cè)
- 如果細(xì)胞內(nèi)酯酶缺失,則建議使用微注射(microinjection)技術(shù)
- 避免使用EDTA等處理樣品
- 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
- 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調(diào)整樣品濃度
- 檢測(cè)敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍
- 本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
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