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胞漿內鈣離子濃度熒光(Fura Red)檢測試劑盒(中文版)

來源:銘修(上海)生物科技有限公司   2021年03月09日 11:20  

MB10152.2 v.A

 

  胞漿內鈣離子濃度熒光Fura Red檢測試劑盒產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

  胞漿內鈣離子濃度熒光Fura Red檢測試劑是一種旨在通過胞漿鈣離子特異性熒光探針Fura-Red-AM與鈣離子結合后,其熒光強度顯著增強,在熒光酶標儀下測量不同激發波長下相對熒光峰值的比值來測定細胞漿總鈣離子濃度*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的其適用于各種活體細胞(動物、人體等)或冰凍切片組織細胞漿鈣離子的濃度檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定,檢測敏感。

 

技術背景

 

鈣是人體中的一種重要電介質和礦物質,占1150克。其中99%的鈣以氟磷灰石鈣calcium fluorophosphate apatite)形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內。鈣具有兩種主要形式:一種是非彌散型蛋白結合鈣,其構成約40%至50%的血清中的總鈣含量;另一種為彌散型游離鈣,其進一步分成具有活性的復合鈣(complexed calcium)和離子鈣(ionized calcium)。鈣對神經肌肉興奮性(neuromuscular excitability)、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經傳導介質、信使傳導等方面起著重要作用。在細胞內,鈣離子主要儲存在線粒體和內質網等細胞器中。其中細胞漿鈣離子在調節鈣離子通道,維持細胞內環境鈣離子平衡方面起著重要作用。細胞漿鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法(flame photometry)、原子吸收分光光度法等技術,但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾,或者受限于儀器的特殊的要求,以及需要細胞漿分離。Fura-Red AMacetoxy-methyl esterFura 2衍生物,一種具有細胞膜通透性,與鈣離子結合產生熒光的染料,通過其不同激發波長420nm/480nm產生的熒光信號比(散發波長550nm)來*測定細胞漿內鈣離子水平。 

 

產品內容

 

  清理液(Reagent A      毫升

  染色液(Reagent B 微升

  介導液(Reagent C      微升

  飽和液(Reagent D      毫升

  陰性液(Reagent E      毫升

  裂解液(Reagent F      微升

產品說明書     1

 

保存方式

 

保存  染色液(Reagent B)和  介導液(Reagent C)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4冰箱里有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于工作液配制的容器

細胞培養箱:用于染色孵育

黑色96孔板:用于樣品操作的容器

熒光酶標儀:用于熒光分析

(共聚焦)熒光顯微鏡:用于熒光染色觀察

實驗步驟

  • 測定準備

 

  • 設定好熒光酶標儀:激發波長420nm480nm,散發波長550nm
  • 測定開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液(Reagent B室溫下融化,然后分別移出xx微升  介導液(Reagent Cxx微升  染色液(Reagent B到新的1.5毫升離心管,標記為  染色工作液,并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 

二、熒光酶標儀檢測

  • 準備1黑色96孔板,標記為:細胞樣品孔、空白對照孔(不含細胞)、大對照孔(含細胞)
  • 小心抽去細胞樣品孔的培養液
  • 加入xx微升  清理液(Reagent A到細胞樣品孔里
  • 加入xx微升  飽和液(Reagent D到大對照孔里
  • 加入xx微升  陰性液(Reagent E到空白對照孔里
  • 分別加入10微升  染色工作液到所有孔里
  • 輕輕搖動黑色96孔板,混勻
  • 放進37℃細胞培養箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心抽去細胞樣品孔里的上清液
  • 小心加入xx微升  清理液(Reagent A細胞樣品孔
  • 重復實驗步驟910一次
  • 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘
  • 加入xx微升  裂解液(Reagent F大對照孔
  • 放進37℃細胞培養箱里孵育15分鐘
  • 即刻放進熒光酶標儀測讀:獲得相對熒光單位(relative fluorescence unitRFU)包括樣品RFU420nm、樣品RFU480nm、空白對照孔RFU420nm、空白對照孔RFU480nm、大對照孔RFU420nm、大對照孔RFU480nm
  • 計算樣品細胞漿鈣離子濃度

 

 

三、(共聚焦)或熒光顯微鏡檢測

 

1準備1個待測的細胞爬片樣品

  • 小心加上xx微升  清理液(Reagent A覆蓋樣品表面
  • 小心移去樣品上的  清理液(Reagent A
  • 移取xx微升  清理液(Reagent A到新的1.5毫升離心管
  • 加入xx微升  染色工作液,混勻 
  • 小心加上上述含有  染色工作液的溶液到樣品上,覆蓋樣品表面
  • 放進37℃細胞培養箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心移去樣品上的  染色工作液
  • 小心加上xx微升新鮮的  清理液(Reagent A
  • 小心移去  清理液(Reagent A
  • 小心加上xx微升新鮮的  清理液(Reagent A
  • 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘
  • 小心移去  清理液(Reagent A
  • 蓋上蓋玻片
  • 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進行觀察:激發波長420480nm,散發波長550nm(細胞漿鈣離子呈現色熒光)

 

四、冰凍切片檢測

 

  • 準備1個待測的冰凍切片
  • 小心加上xx微升  清理液(Reagent A覆蓋切片樣品表面
  • 小心移去樣品上的  清理液(Reagent A
  • 移取xx微升  清理液(Reagent A到新的1.5毫升離心管
  • 加入xx微升  染色工作液,混勻 
  • 小心加上上述含有  染色工作液的溶液到切片樣品上,覆蓋樣品表面
  • 放進37℃細胞培養箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心移去切片上的  染色工作液
  • 小心加上xx微升新鮮的  清理液(Reagent A
  • 小心移去  清理液(Reagent A
  • 小心加上xx微升新鮮的  清理液(Reagent A
  • 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘
  • 小心移去  清理液(Reagent A
  • 蓋上蓋玻片
  • 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進行觀察:激發波長420480nm,散發波長550nm(組織細胞漿鈣離子呈現色熒光)

注意事項

 

  • 本產品為20次(顯微鏡)或60次(96孔板)操作
  • 操作時,須戴手套
  • 可以使用熒光分光光度儀檢測
  • 如果細胞內酯酶缺失,則建議使用微注射(microinjection)技術
  • 避免使用EDTA等處理樣品
  • 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
  • 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度
  • 檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍
  • 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產品

質量標準

 

  • 本產品經鑒定性能穩定
  • 本產品經鑒定檢測敏感

 

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