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胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光(Fura Red)檢測(cè)試劑盒(中文版)

來(lái)源:銘修(上海)生物科技有限公司   2021年03月09日 11:20  

MB10152.2 v.A

 

  胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光Fura Red檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(中文版)

 

主要用途

 

  胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光Fura Red檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)胞漿鈣離子特異性熒光探針Fura-Red-AM與鈣離子結(jié)合后,其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),在熒光酶標(biāo)儀下測(cè)量不同激發(fā)波長(zhǎng)下相對(duì)熒光峰值的比值來(lái)測(cè)定細(xì)胞漿總鈣離子濃度*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的其適用于各種活體細(xì)胞(動(dòng)物、人體等)或冰凍切片組織細(xì)胞漿鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì),占1150克。其中99%的鈣以氟磷灰石鈣calcium fluorophosphate apatite)形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式:一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣,其構(gòu)成約40%至50%的血清中的總鈣含量;另一種為彌散型游離鈣,其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣(complexed calcium)和離子鈣(ionized calcium)。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性(neuromuscular excitability)、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi),鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中細(xì)胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。細(xì)胞漿鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法(flame photometry)、原子吸收分光光度法等技術(shù),但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾,或者受限于儀器的特殊的要求,以及需要細(xì)胞漿分離。Fura-Red AMacetoxy-methyl esterFura 2衍生物,一種具有細(xì)胞膜通透性,與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料,通過(guò)其不同激發(fā)波長(zhǎng)420nm/480nm產(chǎn)生的熒光信號(hào)比(散發(fā)波長(zhǎng)550nm)來(lái)*測(cè)定細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子水平。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

  清理液(Reagent A      毫升

  染色液(Reagent B 微升

  介導(dǎo)液(Reagent C      微升

  飽和液(Reagent D      毫升

  陰性液(Reagent E      毫升

  裂解液(Reagent F      微升

產(chǎn)品說(shuō)明書     1

 

保存方式

 

保存  染色液(Reagent B)和  介導(dǎo)液(Reagent C)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4冰箱里有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于工作液配制的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱:用于染色孵育

黑色96孔板:用于樣品操作的容器

熒光酶標(biāo)儀:用于熒光分析

(共聚焦)熒光顯微鏡:用于熒光染色觀察

實(shí)驗(yàn)步驟

  • 測(cè)定準(zhǔn)備

 

  • 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀:激發(fā)波長(zhǎng)420nm480nm,散發(fā)波長(zhǎng)550nm
  • 測(cè)定開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液(Reagent B室溫下融化,然后分別移出xx微升  介導(dǎo)液(Reagent Cxx微升  染色液(Reagent B到新的1.5毫升離心管,標(biāo)記為  染色工作液,并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 

二、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)

  • 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板,標(biāo)記為:細(xì)胞樣品孔、空白對(duì)照孔(不含細(xì)胞)、大對(duì)照孔(含細(xì)胞)
  • 小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液
  • 加入xx微升  清理液(Reagent A到細(xì)胞樣品孔里
  • 加入xx微升  飽和液(Reagent D到大對(duì)照孔里
  • 加入xx微升  陰性液(Reagent E到空白對(duì)照孔里
  • 分別加入10微升  染色工作液到所有孔里
  • 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板,混勻
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心抽去細(xì)胞樣品孔里的上清液
  • 小心加入xx微升  清理液(Reagent A細(xì)胞樣品孔
  • 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟910一次
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 加入xx微升  裂解液(Reagent F大對(duì)照孔
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘
  • 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀:獲得相對(duì)熒光單位(relative fluorescence unitRFU)包括樣品RFU420nm、樣品RFU480nm、空白對(duì)照孔RFU420nm、空白對(duì)照孔RFU480nm、大對(duì)照孔RFU420nm、大對(duì)照孔RFU480nm
  • 計(jì)算樣品細(xì)胞漿鈣離子濃度

 

 

三、(共聚焦)或熒光顯微鏡檢測(cè)

 

1準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的細(xì)胞爬片樣品

  • 小心加上xx微升  清理液(Reagent A覆蓋樣品表面
  • 小心移去樣品上的  清理液(Reagent A
  • 移取xx微升  清理液(Reagent A到新的1.5毫升離心管
  • 加入xx微升  染色工作液,混勻 
  • 小心加上上述含有  染色工作液的溶液到樣品上,覆蓋樣品表面
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心移去樣品上的  染色工作液
  • 小心加上xx微升新鮮的  清理液(Reagent A
  • 小心移去  清理液(Reagent A
  • 小心加上xx微升新鮮的  清理液(Reagent A
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 小心移去  清理液(Reagent A
  • 蓋上蓋玻片
  • 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)420480nm,散發(fā)波長(zhǎng)550nm(細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)色熒光)

 

四、冰凍切片檢測(cè)

 

  • 準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的冰凍切片
  • 小心加上xx微升  清理液(Reagent A覆蓋切片樣品表面
  • 小心移去樣品上的  清理液(Reagent A
  • 移取xx微升  清理液(Reagent A到新的1.5毫升離心管
  • 加入xx微升  染色工作液,混勻 
  • 小心加上上述含有  染色工作液的溶液到切片樣品上,覆蓋樣品表面
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心移去切片上的  染色工作液
  • 小心加上xx微升新鮮的  清理液(Reagent A
  • 小心移去  清理液(Reagent A
  • 小心加上xx微升新鮮的  清理液(Reagent A
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 小心移去  清理液(Reagent A
  • 蓋上蓋玻片
  • 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)420480nm,散發(fā)波長(zhǎng)550nm(組織細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)色熒光)

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為20次(顯微鏡)或60次(96孔板)操作
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 可以使用熒光分光光度儀檢測(cè)
  • 如果細(xì)胞內(nèi)酯酶缺失,則建議使用微注射(microinjection)技術(shù)
  • 避免使用EDTA等處理樣品
  • 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
  • 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調(diào)整樣品濃度
  • 檢測(cè)敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍
  • 本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

 

免責(zé)聲明

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