激光共聚焦顯微鏡有激發針孔和探測針孔,激發針孔和探測針孔共軛(共焦),共焦點即被探測點,被探測點所在的平面為共焦平面。
激發光經激發針孔后成為點光源,然后通過二色鏡反射和物鏡聚焦點狀照射在樣品上,樣品被激發產生的發射光經同一物鏡,聚焦在探測針孔。探測針孔后面是光電倍增管,非焦平面的光就不能通過針孔(pinhole)被光電倍增管檢測。
激光共聚焦顯微鏡的針孔(Confocal pinhole)一般指探測針孔(detection pinhole),Confocal pinhole的直徑一般自動設置成和艾里斑(airy disc)直徑一致。
艾里斑是點光源通過理想透鏡成像時,由于衍射而在焦點處形成的光斑。中央是明亮的圓斑,周圍有一組較弱的明暗相間的同心環狀條紋,把其中以一暗環為界限的中央亮斑稱作艾里斑。
激光共聚焦顯微鏡的針孔和艾里斑的直徑大小一樣,將有84%的聚焦光到達光電倍增管,圖像的信噪比好。Confocal是逐點激發和逐點檢測,因此有更窄的點擴散函數(Point spread function, PSF.
Confocal側向分辨率高于一般的光學顯微鏡,r(lateral)=0.61 λexc/NA(obj),物鏡的軸向分辨率不如側向分辨率,r(axial)=1.4 λexc n/NA(obj)2
小的針孔將有更好的Z軸分辨率,但需更強的信號。
激光共聚焦顯微鏡優點
1、以激光為光源,在相應的熒光探針標記后,對樣本進行逐點掃描,逐層獲得二維光學橫斷面圖像,具有“細胞CT”的功能,并可通過計算機三維重建軟件支持,獲得三維圖像,并可以任意角度旋轉,觀察細胞,組織立體形態和空間關系;
2、可以對活細胞和組織進行無損傷的觀察,動態測量細胞內的Ca離子濃度和pH值等活細胞生理信息;
3、可對細胞膜的流動性,細胞間通訊,細胞融合,細胞骨架彈性測量等,可用作“光刀子”完成細胞內“外科手術”。這一技術可以對活細胞和組織進行原位動態定量的觀察和測量。
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