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化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞基礎(chǔ)操作方法
化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞該菌株衍生自大腸桿菌菌株B，具有l(wèi)on和ompT蛋白酶缺陷的優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用廣泛的表達(dá)宿主菌之一，其操作方法如下：
1、化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，6分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手滑動(dòng)EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。
2、42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置5分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3、向離心管中加入0.9mL室溫S.O.C.(S.O.C.營(yíng)養(yǎng)豐富，可提高轉(zhuǎn)化效率)或LB培養(yǎng)基。
4、30℃，250rpm復(fù)蘇60分鐘。當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時(shí)，30℃培養(yǎng)可降低錯(cuò)誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化controlpUC19計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，則需37℃，225rpm復(fù)蘇60分鐘
5、篩選平板提前拿出放30℃孵育使平板溫度保持30℃，吸取50-100μl直接涂篩選平板或5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上。
6、將平板倒置放于30℃培養(yǎng)20-24小時(shí)或37℃過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時(shí)，30℃培養(yǎng)可降低錯(cuò)誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化controlpUC19計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，則需37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞注意事項(xiàng):
1、對(duì)不穩(wěn)定DNA的片段克隆或逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體的構(gòu)建，涂板后平板應(yīng)在30℃培養(yǎng)，以減少發(fā)生錯(cuò)誤重組的概率。
2、制備高純度病毒質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)使用新鮮轉(zhuǎn)化的平板接菌，新鮮菌液提取質(zhì)粒，菌液不可低溫保存后使用。
3、對(duì)不穩(wěn)定的克隆或病毒質(zhì)粒優(yōu)先以質(zhì)粒狀態(tài)保存，盡量避免將質(zhì)粒保存在大腸桿菌細(xì)胞中。
4、化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞一般在冰中緩慢融化。插入冰中10分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。混入目的DNA時(shí)應(yīng)輕柔操作。
5、轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或高效率的連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。
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