藥物引發(fā)的肝毒性是造成肝損傷和急性肝衰竭的重要原因之一。因此如何高效的檢測藥物的有效性和安全性對于促進藥物研發(fā)和減少藥物消耗至關重要。人誘導多能干細胞(iPSC)衍生的肝細胞具有典型的成熟細胞的特征和代謝形式，這對于我們用高內涵篩選藥物是非常理想的。

雖然對于如何利用高內涵進行藥物篩選已經(jīng)有了很多標準的程序，但是對于如何通過圖像分析評估不同毒性卻仍非常復雜且大多依靠經(jīng)驗。本文中我們闡述了如何利用 ImageXpress® Micro系統(tǒng)對多參數(shù)肝毒性進行分析。每一個孔或者細胞都會產(chǎn)生 種化合物誘導的細胞反應，而這些反應可以 用MetaXpress® 軟件的自定義模塊進行分析。

優(yōu)勢 ：

簡易快速的對96或 384孔板進行肝毒性篩選

在同一實驗中得到多種肝毒性相關參數(shù)

利用用戶自定義參數(shù)分析，量身定制，結果更準確

從標準活性檢測中獲得更多信息

細胞活性染料(例如Calcein AM)可以用來檢測活細胞中的化合物毒性。首先用各種化合物對肝細胞進行72小時處理并染色。通過 ImageXpress Micro系統(tǒng)的10倍物鏡可以得到肝細胞的圖像，然后我們用 MetaXpress軟件的Multi-Wavelength Cell Scoring應用模塊對活細胞的整個核區(qū)域 (Hoechst復染色)和細胞質區(qū)域(Calcein AM)進行分析(圖1)。

圖1 活細胞染色比單獨細胞計數(shù)提供更準確的毒性信息。Multi-Wavelength Cell Scoring應用模塊對活細胞Calcein AM染色進行分析。右圖中綠色蒙板標記出活細胞的核，灰色為死細胞的核。雖然陰性組和處理組的細胞核數(shù)相近，但是從活細胞百分比可看出處理藥物 Amiodarone毒性很強。另外，從細胞質的染色中還可分析細胞面積、熒光強度等，研究化合物的毒理機制。

線粒體毒性的單染分析

線粒體去極化是缺氧損傷和氧化應激的早期標志。我們可以用JC-10對線粒體膜電位進行檢測，在完整的線粒體中，橙色的J-aggregates肉眼可見， 但是對于膜去極化來說，這種染料可以滲入到細胞質中并發(fā)出特定的熒光波長。在用ImageXpress Micro系統(tǒng)成像前先用化合物處理肝細胞60分鐘并用JC-10染色。系統(tǒng)的自定義模塊可以對健康線粒體中保存的染料和滲透到細胞質中的染料分別定量。通過分析這兩類熒光染色信號強度的比率我們可以得到比之前單一檢測更可靠的數(shù)據(jù)(圖2)。

圖2  Valinomycin改變線粒體膜電位。肝細胞加Valinomycin處理60分鐘。活細胞被JC-10著色并用10 倍鏡拍攝。上：綠色細胞質和紅色線粒體的疊加圖。下：經(jīng)用戶自定義分析的結果蒙板圖，識別出來的線粒體的數(shù)量與化合物濃度相關。

磷脂質病和脂肪變性是常見的肝細胞毒性標志

一些藥物會引起磷脂質病和脂肪變性，這是由脂肪代謝紊亂引起的組織中過多的磷脂質和中性脂 肪聚集造成的。我們可以用成像的方法對肝細胞中的磷脂質和中性脂肪的分布進行檢測，這一檢測可以定位到單細胞水平。圖3我們列舉的實驗中肝細胞被種在384孔板中，孵育了4天，然后用待測化合物處理24小時。

圖3 化合物處理造成的磷脂質病和脂肪變性。肝細胞的磷脂(上)和中性脂肪(下)染色，10倍鏡獲取圖片。化合物處理的細胞脂質染色呈陽性(右)說明了化合物毒性的特殊機制。

從毒性分析中獲得更多信息

 MetaXpress軟件中的自定義模塊編輯器可以讓科學家們針對自己感興趣的參數(shù)進行復雜的分 析。這種自定義模塊已被證明可以有效的定量細胞大小或形狀，活細胞總數(shù)以及凋亡情況(圖 4)。這些模塊也可以應用在圖像處理上，還可以用MetaXpress®PowerCore™ High Content Distributed Image Analysis Software對大量樣本進行高通量篩選分析。

圖4 多參數(shù)肝毒性評價。用戶自定義模塊例子，分析了化合物處理后細胞面積、凋亡發(fā)生率和活細胞數(shù)。

多參數(shù)肝細胞毒性篩選的完整解決方案

多參數(shù)圖像分析可以顯著的提高分析的靈敏性，并且為我們進一步了 化合物毒性發(fā)生機制提供 更多有價值的信息。利用MetaXpress 軟件的自定義模塊編輯器，科學家們可以自由的設計和調整圖像分析模塊并迅速的對毒性進行分析及得到相應結果。Molecular Devices為評估肝細胞毒性提供了靈活的的高內涵篩選方案，這種方法遠好于于傳統(tǒng)的非死即活的簡單檢測。