植物總抗氧化能力（TAC）熒光法（ORAC）定量檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

 植物總抗氧化能力（TAC）熒光法（ORAC）定量檢測試劑是一種旨在通過使用熒光素探針，受到有機氮自由基AAPH的破壞，但在抗氧化劑的存在下，得到抑制，由此通過熒光分光光度儀，觀察其峰值下降程度的變化，來定量檢測對應于標準水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力，即消除自由基等值濃度的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于適用于各種新鮮織物組織包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）等裂解懸液中總抗氧化能力檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩定。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡，甚而導致諸如冠心病、風濕性關節炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統內，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素（bilirubin）等，產生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達到消除或降低ROS的損害。通過氧自由基吸光能力（oxygen radical absorbance capacity；ORAC），即使用熒光素（fluorescein）作為探針，2,2'-偶氮二異丁基脒（（2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride；AAPH）作為過氧自由基供體（peroxyl radical donor），其攻擊探針，產生熒光淬滅，一旦受到抗氧化劑作用，而防止熒光消失，由此評價抗氧化潛力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在熒光分光光度儀（激發波長485nm±20，散發波長528nm±20）的幫助下，觀察其峰值下降程度的變化，并與標準化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。

產品內容

 清理液（Reagent A）     毫升

 低滲液（Reagent B）     毫升

 緩沖液（Reagent C）     毫升

 染色液（Reagent D）     毫升

 氧化液（Reagent E）     管

 標準液（Reagent F）     微升

產品說明書     1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）、 低滲液（Reagent B）和 緩沖液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于標準樣品配制的容器

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

超聲儀：用于破碎細胞

200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的xx毫升 低滲液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管
• 置于200瓦超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里
• 超聲功率為100％，猝擊10秒，2個循環
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 使用 清理液（Reagent A）調整蛋白濃度為100微克/25微升
• 置于冰槽里備用

二、標準液準備

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取xx微升 標準液（Reagent F）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管的 標準液（Reagent F）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的 標準液（Reagent F）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的 標準液（Reagent F）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 樣品測讀

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取xx毫升 緩沖液（Reagent C）到1管 氧化液（Reagent E）里，混勻，置于暗室里，標記為 氧化工作液，避免光照。然后進行下列操作。

• 準備1個黑色96孔板，做好標記：大對照孔、標準樣品孔、待測樣品孔
• 分別移取xx微升 染色液（Reagent D）到黑色96孔板里的每個孔里
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到大對照孔
• 加入xx微升上述配制的 標準液（Reagent F）到相應標準樣品孔里
• 加入25微升樣品（100微克蛋白總量）到待測樣品孔里
• 放進37℃培養箱里孵育30分鐘
• 分別加入xx微升 氧化工作液到標準樣品孔和待測樣品孔里 
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到大對照孔
• 輕輕搖動黑色96孔板，使其混勻
• 放進37℃培養箱里孵育15分鐘
• 即刻放進熒光分光光度儀或熒光酶標儀里測讀：激發波長485nm±20，散發波長528nm±20
• 分析結果：
  • 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為熒光單位；橫座標（X軸）為標準Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 大對照孔為大熒光單位讀數
  • 標準樣品孔和待測樣品孔為實際熒光單位讀數
  • 根據標準曲線獲得樣品對應Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 計算樣品實際總抗氧化能力

• 根據下列公式計算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實際抑制百分率）

【實際熒光單位讀數÷大對照孔熒光單位讀數】X 100％

• IC50：50％抑制率所需的樣品單位：TROLOX等值或樣品蛋白量（毫克/毫升）或樣品細胞量（10⁶細胞）

注意事項

• 本產品為50次操作，包括標準品
• 本產品測試范圍為100納摩爾至1微摩爾Trolox等值
• 操作時，須戴手套
• 樣品制備的所有操作均須在4℃狀態下進行
• 用戶可以調整標準曲線區間
• 測試前，樣品須新鮮收集
• 樣品須清澈
• 樣品讀數越高，下降程度越小，抗氧化能力越高
• 可以使用比色皿檢測
• 如果樣品抗氧化劑濃度過高或過低， 建議稀釋或增加樣品容量或濃度
• 如果測試樣品很多，建議使用排槍移液
• 本公司提供系列抗氧化分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感