真菌/酵母細胞內氧化應激活性氧高質熒光測定試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 真菌/酵母細胞內氧化應激活性氧高質熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在細胞氧化條件下，產生熒光，來定量檢測細胞內活性氧族的生成和增加的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種實驗用真菌/酵母菌株細胞內氧化應激活性氧的分析。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老和代謝等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定，滯留持久，熒光清晰。

技術背景

真菌/酵母細胞是一種低等單細胞真核生物，具有細胞生長快，易于培養，遺傳操作簡單明了等原核生物的特點。作為模式生物，它具有比較完備的基因表達調控機制和表達產物的加工修飾能力，在分子遺傳學方面認識早，作為外源基因表達的細胞宿主。超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級產品，一種*自由通過細胞膜，并在細胞內長期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧化基、次氯酸等氧化，便產生熒光。據此測定細胞內活性氧族的濃度。

產品內容

 清理液（Reagent A）     80毫升

 染色液（Reagent B）    100微升

 稀釋液（Reagent C）     20毫升

 溶解液（Reagent D）     10毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于真菌/酵母染色的容器

載玻片：用于染色觀察

微型臺式離心機：用于沉淀真菌/酵母細胞

培養箱或恒溫水槽：用于染色孵育

比色皿：用于熒光定量分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細胞熒光分析

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

熒光分光光度儀：用于細胞熒光定量分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出5微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入995微升 稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為 染色工作液，置入冰槽里。然后進行下列操作。

• 準備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷細胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預冷的 清理液（Reagent A），混勻
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復實驗步驟5至7一次
• 加入1毫升含有 染色液（Reagent B）和 稀釋液（Reagent C）的 染色工作液，混勻（注意：參見注意事項7）
• 放進28℃培養箱里或恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預冷的 清理液（Reagent A），混勻
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入500微升預冷的 清理液（Reagent A），混勻
• 放進冰槽里
• 選擇下列方式之一進行操作：
  • 即刻進行細胞流式儀分析：波長488nm氬離子激光，觀察50000個細胞以上――

波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取5微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發波長490nm，散發波長530nm――

綠色熒光增強，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取500微升上述細胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升 溶解液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數次

4）放進熒光分光光度儀：激發波長490nm，散發波長530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液
• 建議染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 孵育時，必須避免光照
• 本產品染色劑不易洗掉，染色持久
• 根據不同菌株類型，可以調整 染色工作液的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
• 本公司提供陽性對照甲萘醌溶液（GMS12041），觀察細胞熒光增強現象
• 本公司同時提供 真菌/酵母細胞內活性氧初級熒光測定試劑盒（GMS10016.8），滿足不同用戶需求
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰