植物堿性焦磷酸酶（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  植物堿性焦磷酸酶（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量檢測試劑是一種旨在使用無機(jī)焦磷酸，在堿性焦磷酸酶去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后峰值的變化，采用比色法測定其峰值的變化，以此進(jìn)行測算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種植物組織，包括種子、球莖（bulb）、塊莖（tuber）、根（root）、種葉（coleoptile）和葉片裂解懸液樣品或純化以及粗提的酶蛋白的堿性焦磷酸酶活性及其抑制劑的檢測。 產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

焦磷酸酶（Pyrophosphatase；PPase；；EC3.6.1.1），又稱為無機(jī)焦磷酸酶（ inorganic pyrophosphatase），屬于磷酸酶家族，包括磷酸單酯酶（phosphomonoesterase）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase）等。通過釋放磷酸根，參與DNA合成、RNA合成、輔酶合成、鈣吸收、骨形成、氨基酸合成和脂肪酸代謝的激活等代謝活動。焦磷酸酶分為堿性和酸性，前者作用于合成代謝，而后者作用于分解反應(yīng)。焦磷酸酶催化無機(jī)焦磷酸水解產(chǎn)生2個磷酸根離子的反應(yīng)，為能量釋放反應(yīng)（exergonic reaction）。在植物中，尤其碳4或碳3植物的葉片中，活性。在固碳還原和光合作用起著重要作用成為碳4植物通路的指標(biāo)。基于底物無機(jī)焦磷酸，在堿性條件下，受到堿性焦磷酸酶的去磷酸化作用，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后，在分光光度儀下（660nm波長）產(chǎn)生峰值的變化，由此測定堿性焦磷酸酶的活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）  毫升

  裂解液（Reagent B）    毫升

  緩沖液（Reagent C）  毫升

  陰性液（Reagent D）    毫升

  反應(yīng)液（Reagent E） 微升

  顯色液（Reagent F） 毫升

  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G） 微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存  裂解液（Reagent B）和  顯色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；  顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸； 有效保證3月

用戶自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織樣品

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品收集

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織，并秤重以確定組織重量200毫克 

• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

• （選擇步驟）加入xx毫升  清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx微升  裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下） 
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－  MB30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如植物裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為660nm，并置零  
• 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
• 按下表分別加入  陰性液（Reagent D）和  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到每個離心管，混勻
• 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

• 移取200微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿
• 在30℃溫度下孵育20分鐘
• 加入xx微升  顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實驗步驟1至6四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

• 樣品背景測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升待測樣品（總量100微克植物裂解萃取液蛋白） 
• 在30℃溫度下孵育10分鐘
• 加入xx微升  陰性液（Reagent D），混勻
• 加入xx微升  顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

• 樣品活性測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升待測樣品（總量100微克植物裂解萃取液蛋白） 
• 在30℃溫度下孵育2分鐘
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent E）
• 在30℃溫度下孵育10分鐘
• 加入xx微升  陰性液（Reagent D），混勻
• 加入xx微升  顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

• 計算樣品活性

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括5次（點）標(biāo)準(zhǔn)測定
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線測定只需1條
• 樣品背景讀數(shù)大于1.0，建議稀釋樣品至0.5-1.0之間
• 如果加樣，樣品背景讀數(shù)可以跳過
•   顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
• 樣品切忌使用磷酸緩沖液處理
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 建議使用比色皿測定
• 如果使用96孔板測定，建議反應(yīng)孵育時，置于平式搖蕩儀搖蕩孵育，速度為50RPM
• 如果用戶沒有660nm波長，可以使用600至660nm的任一波長替代
• 吸光讀數(shù)增高，表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－  MB30030.1）
• 堿性焦磷酸酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 8.9的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的磷
• 本公司提供系列磷酸酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確