活體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光（TMRM）測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

（中文版）

主要用途

 活體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光（TMRM）測(cè)定試劑是一種旨在通過四甲基羅丹明甲酯染料，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體膜電位的變化，即內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低，來(lái)分析線粒體內(nèi)膜功能的完整性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種線粒體制備物的功能檢測(cè)。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽(yáng)離子染料，作為電勢(shì)測(cè)定（potentiometric）熒光探針：具有親脂性的，且細(xì)胞低毒和光穩(wěn)定； 第二，與線粒體內(nèi)膜負(fù)電極結(jié)合而聚集；第三，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進(jìn)入線粒體后，被線粒體俘獲，分布和結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上，呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光。線粒體膜電位的高低變化決定了TMRM的分布濃度。電位高，TMRM在線粒體的濃度高，顯示為強(qiáng)力紅色或桔紅色；反之，TMRM彌散在胞漿內(nèi)，熒光減弱表明線粒體膜電位受到損害。 

產(chǎn)品內(nèi)容

 染色液（Reagent A）    微升

 稀釋液（Reagent B）    毫升

 清理液（Reagent C）    毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞脫落收集

1.5毫升離心管：用于活體細(xì)胞線粒體染色的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞收集的操作

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于活體細(xì)胞線粒體熒光定性分析

比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于活體細(xì)胞線粒體熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于活體細(xì)胞線粒體熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent A）置入冰槽里融化， 稀釋液（Reagent B）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升 染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升 稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為 染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

一、直接法

• 準(zhǔn)備1個(gè)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約10⁵細(xì)胞數(shù)）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 輕輕沿著孔壁加入xx毫升  清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去xx毫升  清理液（Reagent C）
• 加入xx微升含有 染色液（Reagent A） 和 稀釋液（Reagent B）的 染色工作液，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）
• 小心抽去xx微升 染色工作液
• 小心加入xx微升 清理液（Reagent C）（注意：檢測(cè)前置于冰槽里）
• 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（濾波器激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm ）――可見

亮橘紅色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

二、間接法

• 準(zhǔn)備1個(gè)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約30萬(wàn)細(xì)胞數(shù)）
• 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細(xì)胞）
• 加入xx毫升  清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心移出xx毫升  清理液（Reagent C）到15毫升錐形離心管（收集洗脫細(xì)胞）
• 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
• 輕輕抖動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞脫落，然后加入1毫升*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn) 臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent C）
• 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群
• 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管或細(xì)胞流式儀測(cè)試管
• 加入xx微升含有 染色液（Reagent A） 和 稀釋液（Reagent B）的 染色工作液
• 輕度渦旋震蕩2秒
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）
• 放進(jìn) 臺(tái)式微型離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent C）（注意：檢測(cè)前置于冰槽里）

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

• 混勻后，移出50微升在載玻片上
• 即刻進(jìn)行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（濾波器激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm） ――可見亮橘紅色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

選擇二、細(xì)胞流式儀分析

• 混勻后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：觀察50000個(gè)細(xì)胞以上

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定

• 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里
• 即刻進(jìn)行熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm），獲得相對(duì)熒光單位（RFU）：RFU值高表明線粒體膜電位正常

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（0.5毫升工作液）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 待測(cè)細(xì)胞建議不要過于饑餓或過度生長(zhǎng)
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
• 孵育時(shí)，避免光照
• 健康細(xì)胞和線粒體呈現(xiàn)橘紅色；死亡或凋亡細(xì)胞及損傷線粒體呈現(xiàn)黯淡或無(wú)熒光
• 本公司提供FCCP溶液，作為線粒體膜電位破壞分子，觀察熒光顯著減弱現(xiàn)象
• 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰