MB50798.1 v.A

  細(xì)胞P300/CBP組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法（340nm）

定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細(xì)胞P300/CBP組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法（340nm）定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過通用底物H3多肽，在敏感性抑制劑存在與否的情況下，通過P300/CBP的作用，將乙酰輔酶A上的乙酰基團(tuán)，轉(zhuǎn)移到多肽分子上的過程中，釋放出巰基輔酶A，進(jìn)而使用α-酮戊二酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)中伴隨的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的還原反應(yīng)， 即采用光度法測(cè)定其還原后峰值的變化，來測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、核蛋白樣品、部分或*純化酶樣品中P300/CBP HAT的特異活性檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

核小體（nucleosome）是染色質(zhì)的小結(jié)構(gòu)單位，由組蛋白H2A-H2B雙體和H3-H4雙體構(gòu)成的組蛋白八體結(jié)構(gòu)（octamer），外層涵蓋146堿基DNA。其結(jié)構(gòu)中組蛋白N末端為游離狀態(tài)，且高度進(jìn)化保留，在特定氨基酸部位發(fā)生諸如甲基化、乙酰化、磷酸化修飾，以改變其電荷和功能。組蛋白上特定賴氨酸殘基的ε氨基基團(tuán)的乙酰化通過組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone Acetyltransferase；HAT；EC2.3.1.48）催化產(chǎn)生，具有表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)作用，達(dá)到染色體重構(gòu)（remodeling），染色質(zhì)松弛打開，促使基因轉(zhuǎn)錄。其功能異常將導(dǎo)致腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、AIDS和炎癥。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，又稱為賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（lysine acetyltransferase）；KAT），分成二型，細(xì)胞核內(nèi)的A型，包括P300/CBP、Gcn5、TAFII250等，和細(xì)胞漿內(nèi)的B型，例如Hat1。其又分成六類：P300/CBP（P300/cAMP Responsive Element-Binding Protein），包括P300、CBP等；GNAT（Gcn5-related N-acetyltransferase），包括Gcn5、PCAF、Hat1、Elp3、Hpa2、Hpa3、ATF-2、Nut1等；MYST（MOZ、ybf2/sas3、sas2、Tip60），還包括Esa1、MOF、MORF、HBO1等；核受體共激活因子（nuclear receptor co-activator），包括SRC-1、SRC-3、ACTR、TIF2；TAFII250（TATA box binding protein associated factor）；TFIIIC（transcriptional factor IIIC）等。其中P300/CBP家屬中包括P300、CBP、和P300/CBP相關(guān)因子（P300/CBP Associated Factor；PCAF），這是個(gè)發(fā)現(xiàn)的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，成為結(jié)構(gòu)、機(jī)制和功能研究的代表。P300（又稱為KAT3B），E1A腫瘤結(jié)合蛋白和CBP（又稱為KAT3A），cAMP反應(yīng)元素結(jié)合蛋白（cAMP Responsive Element-Binding Protein；CREB）是全面性轉(zhuǎn)錄共激活因子（global transcription coactivator），位于核內(nèi)，屬于旁系同源（paralogue）蛋白，功能相等，序列相似，相同的結(jié)構(gòu)域（包括核受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鋅指（zinc finger）結(jié)構(gòu)域、溴區(qū)結(jié)構(gòu)域（bromodomain）、內(nèi)部大乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域等），具有內(nèi)生性乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，乙酰化組蛋白和非組蛋白，與300多個(gè)DNA結(jié)合性轉(zhuǎn)錄因子、病毒轉(zhuǎn)化因子、核受體、信號(hào)分子等反應(yīng)、其功能在于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞分化、控制細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、整合多種轉(zhuǎn)錄水平信號(hào)依賴性通路（例如G蛋白通路）、修正基因表達(dá)、DNA修復(fù)和復(fù)制、蛋白間反應(yīng)和蛋白穩(wěn)定性，作用于胚胎發(fā)育尤其是器官生成，以及調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞、神經(jīng)突觸活性和長(zhǎng)期記憶形成等。P300和CBP異常，會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展、糖尿病、哮喘、髓細(xì)胞白血病（myeloid cell leukemia）、闊拇指巨趾綜合征（Rubinstein-Taybi syndrome）。基于底物H3組蛋白多肽Ac-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala- Pro-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Thr- Lys-NH₂ （H3組蛋白N末端5至23氨基酸殘基），在P300/CBP敏感性抑制劑C646存在與否的情況下，通過P300/CBP的作用，將乙酰輔酶A上的乙酰基團(tuán)，轉(zhuǎn)移到多肽分子上，由此產(chǎn)生乙酰化多肽和巰基輔酶A（CoA-SH），進(jìn)而通過α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase）反應(yīng)系統(tǒng)中，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）還原為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析P300/CBP組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

  裂解液（Reagent A） 毫升

  分離液（Reagent B） 毫升

  清理液（Reagent C） 毫升

  萃取液（Reagent D） 毫升

  緩沖液（Reagent E）      毫升

  反應(yīng)液（Reagent F）      微升

  底物液（Reagent G）      微升

  專性液（Reagent H）      微升

  陰性液（Reagent I）      微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存  反應(yīng)液（Reagent F）、  底物液（Reagent G）和  專性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：用于清洗細(xì)胞樣品

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

96孔板或200微升1厘米光徑比色皿：用于反應(yīng)和光度分析的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）
• 小心抽去培養(yǎng)液
• 小心加入10毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升  裂解液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管 
• 強(qiáng)力渦旋震蕩10秒
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 加入xx毫升預(yù)冷的  分離液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的  清理液（Reagent C）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g
• 小心抽去上清液
• 小心加入xx微升預(yù)冷的  萃取液（Reagent D），混勻
• 轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 超聲處理30秒：功率100瓦，10秒一次，間隔2分鐘，重復(fù)2次（注意：保持在冰槽里）
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－   30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔2分鐘，讀數(shù)6次（共10分鐘），并置零 
•   緩沖液（Reagent E）置于室溫下均衡溫度

• 樣品總活性測(cè)定

• 加入xx微升  緩沖液（Reagent E）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent F）
• 加入xx微升  底物液（Reagent G）
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升  陰性液（Reagent I）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，獲得背景讀數(shù)（10分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品總活性測(cè)定

• 加入xx微升  緩沖液（Reagent E）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent F）
• 加入xx微升  底物液（Reagent G）
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測(cè)樣品（注意：50微克核蛋白；樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，獲得樣品總活性讀數(shù)（10分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品非特異活性測(cè)定

• 加入xx微升  緩沖液（Reagent E）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent F）
• 加入xx微升  底物液（Reagent G）
• 加入xx微升  專性液（Reagent H）
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測(cè)樣品（注意：50微克核蛋白；樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，獲得樣品非特異活性讀數(shù)（10分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 計(jì)算樣品實(shí)際活性

• 總活性和非特異活性

• 樣品特異活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 樣品處理時(shí)，避免使用巰基乙醇、DTT等
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行光度測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化
• 測(cè)定值讀數(shù)越高，表明酶活性越高
• 光度測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 待測(cè)樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒   30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• P300/CBP組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾NAD所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感