色譜柱技術始于上世紀50年代，隨著填料和填充技術的發展，色譜柱技術日益成熟，功能也日趨完善，目前已被廣泛應用于生命科學、環保、材料、食品、藥物開發等領域。

液相色譜柱在色譜分析系統中主要起著分離檢測物質的作用，如同色譜系統的心臟，同時也是易損耗品。為了減少損耗，色譜柱的使用維護至關重要！

液相色譜柱使用過程常用問題包括色譜柱連接、色譜柱活化、色譜柱使用、色譜柱維護、色譜柱保存等。

01

色譜柱連接

色譜柱安裝方向

色譜柱安裝應按照同一個方向連接使用，且需要按照色譜柱上的方向指示連接，盡量避免色譜柱反向連接！

常見色譜柱連接的問題主要有兩種，安裝色譜柱時管線伸出接頭長度過長，使得螺紋擰入較淺，會導致密封性不好而漏液，進一步引起基線漂移或響應降低；反之，會在管線前段出現死體積，引起峰形展寬，靈敏度降低。

理想的接頭連接應具備以下特性：管線與接口之間無死體積；在超高壓和高溫下始終避免泄漏；優異的長期使用穩定性，防止管線滑動；簡便易用。

管線的選擇也非常重要，分析型液相系統常用的規格是0.12和0.17mm內徑的管線。更換管線時首先要確認當前管線的規格、并更換相同內徑和長度的管線，否則會造成更換前后結果的不一致，因為管線體積會影響系統柱外體積，從而影響峰形和保留時間。 

02

反相柱活化平衡

1） 首先，使用甲醇或乙腈沖洗約20 倍柱體積 。

2）若流動相含有緩沖鹽，使用與流動相中初始比例相等比例的超純水和有機相沖洗過渡約20 倍柱體積，再用含緩沖鹽的流動相平衡沖洗約20 倍柱體積或以上。

3） 若流動相不含緩沖鹽，可直接用流動相平衡色譜柱，大約20 倍柱體積或以上。

4）當基線和壓力平穩后測試，判斷是否充分平衡以連續進樣結果的重現為準。若不夠可延長流動相的平衡時間。

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反相柱沖洗保存

1）使用50:50 甲醇或乙腈與水的混合溶液沖洗20-30 倍的柱體積；

2）使用純甲醇或乙腈沖洗20-30倍柱體積；

3）儲存之前將堵頭緊緊密封在柱端接頭上，以免填料變干。

04

反相色譜柱清洗再生

清洗或反沖清洗反相色譜柱時，用以下溶劑至少各30倍柱體積沖洗色譜柱：

斷開色譜柱與檢測器的連接，將管線留在色譜柱末端，將其放入接收液體的燒杯中，先用不含緩沖液鹽的流動相沖洗（水/有機相），然后用 100% 有機相（甲醇和乙腈）沖洗，檢查壓力是否回歸正常，如果沒有，再進行下一步操作。

如壓力沒有回歸正常，丟棄色譜柱或考慮用更強的條件清洗：75% 乙腈/25% 異丙醇、100% 異丙醇、100% 二氯甲烷 、100% 己烷。

值得注意的是，無論是使用己烷還是二氯甲烷，使用之前或恢復使用反相流動相之前必須用異丙醇進行沖洗。

關于色譜柱反沖

雖然色譜柱不應輕易反沖，但當明確知道超壓來自顆粒物堵塞篩板或柱頭污染時，反沖是有效補救方法。反沖色譜柱可使顆粒物快速被沖出，此外還可快速沖出柱頭強吸附污染物，柱子反沖后仍然正向連接使用。不過，反沖也會帶來負面影響，如可能導致柱床松動、發生保留時間改變、小粒徑的色譜柱反沖可能導致填料流出等。

其中，可以反沖的色譜柱有：粒徑大于2um的色譜柱（2.7、3、3.5、4、5μm等）；而不可反沖的色譜柱有：粒徑小于2um的色譜柱（1.8μm RRHD/RRHT；1.9μm Poroshell）。

05

色譜柱使用過程中常見問題

液相色譜柱使用過程中常見的問題包括pH值、溫度、溶劑耐受、壓力、樣品等。色譜柱使用條件不得超出廠家建議的范圍，包括壓力，pH范圍，水相耐受，柱溫等。當測試條件接近色譜柱使用范圍的極限值時，柱壽命會受影響。

01

C18柱子如何調PH和溫度以提高分離度呢？

答：通過調整pH和柱溫優化分離度，這是方法開發中非常重要的手段。簡單來講，中性或不可電離化合物對pH變化不敏感。對于可電離化合物而言，可以通過調整流動相pH值，控制化合物電離狀態來改變化合物的反相保留。降低pH可增大酸性化合物保留，而提高pH則可增加堿性化合物保留。通過調整pH改變化合物保留進而優化各個組分之間的分離度。

通常提高柱溫使得傳質加快，保留也會降低，但是不同化合物保留對溫度變化敏感程度不同，因此也可以通過調整柱溫改變各個組分的保留時間來優化分離度。

02

色譜柱總超壓可能是什么原因呢？

答：超壓一般是液相流路內部包括色譜柱在內可能有堵塞。需要先做分段排查確定堵塞的部位，再根據堵塞部位排查引起堵塞的可能原因。

如果是色譜柱堵塞，比較常見的原因有很多，如樣品臟、基質復雜并且沒有經過良好的預處理，或者預處理之后進入液相系統后又析出從而造成堵塞或污染（解決方法：加強樣品預處理）；色譜柱超壓或超出pH范圍使用導致填料碎裂，碎屑顆粒堵塞色譜柱（解決方法：根據測試條件選擇合適色譜柱，避免超范圍使用）；儀器使用過程中部件磨損碎屑造成的堵塞（解決方法：及時更換受損部件）等等，都會引起系統色譜柱壓力升高。

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C18柱子出峰時間拖后是什么因素影響？用一段時間出峰時間就拖后了，請問與流動相有沒有關系？

答：液相色譜中影響化合物保留的主要因素包括：樣品，色譜柱，流動相（流速，組成，比例等），柱溫等。使用過程中發現保留時間漂移的話，需要從以下幾個影響因素進行排查：可以先通過對比保留時間漂移前后相同條件下的壓力曲線是否重現，從而初步排查可能的原因。若壓力曲線不重現，首先確認測試條件是否有改動，檢查流動相流速，組成，比例等是否改變，是否存在漏液或進氣泡引起的流速和比例變化；對流動相組成變化敏感的樣品和方法，應確保每次配制流動相的重現性；檢查色譜柱是否堵塞污染；儀器控溫是否準確等等，可能的原因比較多，具體原因需要進一步排查。

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色譜柱用什么流動相保存好？用純有機試劑是否容易干？

答：反相柱可以用HPLC級的甲醇或者乙腈保存，注意緊密連接堵頭。正常情況下只要堵好堵頭，溶劑是不容易干的。當然在保存溶劑中添加5%-10%的水，也沒有問題。

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乙腈流動相總是容易聚合，有沒有什么解決辦法?

答：乙腈的聚合需要一定條件和時間，務必使用品質可靠的HPLC級溶劑，并且保證所使用溶劑盡可能新鮮。如果是放置保存比較久的乙腈溶劑，使用之前先過濾一下再用會有一定改善。

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小分子極性物質一般選用什么液相色譜柱？

答：可以先嘗試用能夠耐受高比例水相的柱子，提高流動相水相比例來增強保留。如果是可電離化合物，如酸性或者堿性化合物，可以在反相模式下先嘗試通過調整流動相pH增大保留，酸性化合物需降低流動相pH，堿性化合物則提高流動相pH，根據pH條件選擇可以耐受的色譜柱。如果調整pH后反相模式保留仍然很弱，您還可以考慮使用其他保留模式的色譜柱，例如HILIC柱，HILIC-Z,HILIC-OH5，或者純硅膠的HILIC柱等等，也可以使用離子交換色譜柱或者正相色譜等。

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柱子分離效果差了該怎么處理？

答：導致色譜柱分離度降低的原因，主要是色譜柱柱效下降及色譜柱選擇性發生改變。引起柱效下降的原因比較多，如果是連接不當造成的柱效損失，重新正確連接即可。如果是色譜柱使用中由于柱子污染引起的柱效下降或選擇性改變導致的分離度降低，可以嘗試對柱子進行清洗再生。如果是色譜柱本身的損傷引起的柱效下降分離度變化，這種通常是不可逆的，只能更換色譜柱，并且在后續使用新色譜柱的時候盡量避免各種損傷柱子的操作。