Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒說明書

Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit

目錄號：K0199   

保存：蛋白酶抑制劑混合物：-20℃

   其它組分：2                   - 8  度    

組分說明

Catalog no.               K0199B

Kit Size                   50 次

Nc-試劑   A                   50 ml

Nc-試劑    B                  3 ml

Nc-試劑   C                   25 ml

蛋白酶抑制劑混合物                       750  μl

產(chǎn)品簡介

    Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒能夠簡單、快速的提取來源于哺乳動物細(xì)胞及組織的細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白，所提取蛋白保持生物學(xué)活性。本試劑盒首先通過細(xì)胞漿蛋白抽提試劑裂解細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞漿蛋白，然后通過離心得到細(xì)胞核沉淀。

后通過細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。抽提獲得的核蛋白及漿蛋白純度高，有效避免核/漿蛋白的交叉污染，可以用于Western、Gel Shift、報告基因檢測以及酶活力測定等后續(xù)操作。

注意事項

1. 如需提取磷酸化蛋白請在抽提試劑中加入磷酸酶抑制劑。

2. 所有樣品操作請置于冰上進(jìn)行。

3. 可根據(jù)具體實驗情況調(diào)整試劑用量，保證各試劑使用比例為                               Nc-試劑   A：Nc-試劑     B：Nc-試劑     C=100：5.5：50。

4. 可以采用更高的速度來離心。

5. 戴手套操作。                                                                                                                                                                

操作步驟        

l    細(xì)胞中胞漿、胞核蛋白的提取

 1.  收集細(xì)胞，計數(shù)。

 2.  請在蛋白抽提前取出抽提試劑Nc-試劑A和Nc-試劑C進(jìn)行預(yù)冷，按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μ抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

     注意：在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。

 3.  1×107細(xì)胞中加入1 ml Nc-試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），                   渦旋5秒以充分混勻，冰上孵育20分鐘。

    注意：各種細(xì)胞的特性不同，需要根據(jù)不同細(xì)胞的特性調(diào)整Nc-試劑A的用量，如果蛋白濃度小，按比例減少Nc-試劑A及后續(xù)Nc-試劑B、Nc-試劑C的用量。

 4.  加入55    μl Nc-試劑    B，渦旋5秒以充分混勻，冰上孵育1分鐘。

 5.  4℃  12,000 rpm（13,400×g）離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測（此提取液為胞漿蛋白）。

 6.  向上步所得的沉淀中加入500μl Nc-試劑C（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），                      渦旋5秒以充分混勻，重懸沉淀，冰上孵育40分鐘，每隔10分鐘渦旋混勻一次，每次約15-30秒。

 7.  4℃  12,000 rpm離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測（此提取液為胞核蛋白）。 組織中胞漿、胞核蛋白的提取

 1. 取材，保存組織。

 2. 請在蛋白抽提前取出抽提試劑Nc-試劑A和Nc-試劑C進(jìn)行預(yù)冷，按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

     注意：在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。

 3. 稱組織重量，每100 mg組織中加入1 ml Nc-試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），用勻漿器在冰上充分勻漿，

    放置在冰上孵育20分鐘。

    注意：各種組織的特性不同，需要根據(jù)不同組織調(diào)整Nc-試劑A的用量，如果蛋白濃度小，按比例減少Nc-試劑A及后續(xù)Nc-試劑B、Nc-試劑C

的用量。

 4. 加入55μl Nc-試劑B，渦旋5秒以充分混勻，放置在冰上孵育                        1分鐘。

 5.  4℃12,000 rpm（13,400×g）離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測（此提取液為胞漿蛋白）。

 6. 向上步所得的沉淀中加入500μl Nc-試劑C（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），                      渦旋5秒以充分混勻，重懸沉淀，冰上孵育40分鐘，每隔10分鐘渦旋混勻一次，每次約15-30秒。

 7.  4℃12,000 rpm離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測（此提取液為胞核蛋白）。

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