CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新一代基因編輯工具，因其構(gòu)建方便、設(shè)計(jì)靈活，操作簡(jiǎn)單、效率高成本低，成為基因敲除的新一代利器。該系統(tǒng)由有DNA切割活性Cas9蛋白和識(shí)別特異靶點(diǎn)的sgRNA組成。Cas9是一種核酸內(nèi)切酶，它和sgRNA構(gòu)成的復(fù)合體能與DNA分子上的特定序列結(jié)合，并在PAM序列(幾乎存在于所有基因)上游切斷DNA雙鏈。DNA被切斷后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，造成基因的缺失、移碼、插入等隨機(jī)突變模式，達(dá)到修復(fù)雙鏈斷裂的目的，同時(shí)造成靶向基因敲除。

CRISPR/Cas9基因敲除細(xì)胞系/細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)流程

案例展示：
1．構(gòu)建慢病毒載體的crispr sgRNA的單質(zhì)粒系統(tǒng)。
2．經(jīng)過293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染，包裝得到慢病毒。
3．通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式感染目的細(xì)胞。
4．通過抗生素篩選和單克隆挑取后，擴(kuò)大培養(yǎng)。
5．經(jīng)挑取單克隆細(xì)胞后，提取得到單克隆細(xì)胞的基因組DNA，再通過PCR擴(kuò)增目的基因編輯位點(diǎn)的上下游區(qū)段，經(jīng)過TA克隆連接到PMD19T的載體上，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，選取10個(gè)菌落測(cè)序鑒定得到單克隆的細(xì)胞是否單一。
下圖是交付給客戶的單克隆細(xì)胞驗(yàn)證結(jié)果。

T7E1酶切法突變體檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)CRISPR/Cas9的編輯效率：
賽爾瑞成采用T7E1酶切法突變體檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)CRISPR/Cas9的編輯效率。若sgRNA有效編輯了基因組DNA，則目的基因在修復(fù)后會(huì)出現(xiàn)堿基缺失突變現(xiàn)象，通過分析T7E1酶處理目標(biāo)DNA片段的雜合鏈后的情況，從而驗(yàn)證Cas/sgRNA的編輯效率，用于篩選編輯效率高的sgRNA。

公司簡(jiǎn)介：

賽爾瑞成（北京）生命科學(xué)技術(shù)有限公司建有專業(yè)的分子生物學(xué)平臺(tái)、原核發(fā)酵平臺(tái)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)、蛋白純化和制劑平臺(tái)。賽爾瑞成能進(jìn)行重組蛋白、多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體（包括納米抗體、單鏈抗體、雙特異抗體等）、細(xì)胞治療產(chǎn)品的研發(fā)工作。賽爾瑞成匯聚了一批分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物工程等方面的專家，技術(shù)團(tuán)隊(duì)成員均來自國(guó)內(nèi)外科研院所和生物技術(shù)企業(yè)，擁有雄厚的研發(fā)實(shí)力和產(chǎn)品開發(fā)經(jīng)驗(yàn)。
 

實(shí)驗(yàn)室建設(shè)：