主要用途

    冰凍切片皮爾斯（PERLS-DAB）非血紅素鐵（三價）強化染色試劑是一種旨在使用氰亞鐵酸鹽結合反應技術，進一步使用二氨基聯苯胺的強化擴增，分析冰凍組織切片中三價正鐵離子（ferric ion）沉積現象的經典的技術方法。該技術經過精心改良皮爾斯（Perls）方法、成功實驗證明的。主要適用于冰凍組織切片的三價正鐵離子檢測。廣泛用于動物中樞神經組織等病理生理的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

        三價鐵（ferric）是氧化數為三的鐵。通過無機礦物酸（mineral acid）水解，三價鐵從蛋白結合形態中釋放出來。三價鐵具有難溶性的特點。通常三價鐵先被還原使之與有機配位體分離，分離出來的二價鐵被生物體吸收。動物和人體的整個消化道都可以吸收，植物在根尖處吸收。機體大約有三分之二的鐵存在于紅細胞的血紅蛋白和肌肉的肌紅蛋白中，20％的鐵以不同形式存在于肝、脾和其他組織中。鐵作為氧的載體，保證組織內氧的正常輸送，在細胞生物氧化和能量代謝過程中發揮著重要作用。正常脾組織和骨髓里含有少量的三價鐵。組織中過量存在三價鐵，可能與血色病（hemochromatosis）和含鐵血黃素沉著癥（hemosiderosis）有關。由于中樞神經組織中小膠質細胞（microglia）、少突膠質細胞（oligodendroglia）和神經元（neurons）以及非神經組織含有非血紅素性三價鐵的輕度沉積，使用常規的皮爾斯（PERLS）方法敏感性不足，采用二氨基聯苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）的強化擴增效應，分析三價鐵沉積現象。通過酸性氰亞鐵酸鹽（ferrocyanide）與組織中三價正鐵離子（ferric ion）結合，成為亞鐵氰化鐵（ferric ferrocyanide），進而催化二氨基聯苯胺的氧化，電子供體DAB失去電子，而呈現出顏色變化和沉積，形成棕褐色不溶性產物。其反應原理如下：

產品內容

清理液（Reagent A）  毫升

固著液（Reagent B）  毫升

染色液（Reagent C）  毫升

酸性液（Reagent D）  毫升

封阻液（Reagent E）  毫升

顯色液（Reagent F）  瓶

稀釋液（Reagent G）  毫升

反應液（Reagent H）  毫升

產品說明書  1份

保存方式

保存顯色液（Reagent F）在-20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent C）和顯色液（Reagent F），避免光照；染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）具有腐蝕性和毒性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

2毫升離心管：用于工作液配制的容器

小型染色缸：用于石蠟切片的去石蠟和染色操作

光學顯微鏡：用于組織細胞染色后觀察分析

實驗步驟

• 樣本固著處理
• 取出待測的5微米厚的冰凍切片  
• 小心加上xx微升清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個樣品表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 小心加上xx微升固著液（Reagent B），鋪滿整個樣品表面
• 室溫下，孵育10分鐘
• 小心移去切片上的固著液（Reagent B）
• 小心加上xx微升清理液（Reagent A），清洗樣品表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 重復實驗步驟7至8一次
• 樣本染色處理

操作開始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）置入室溫下，分別移出1毫升到2.2毫升離心管，混勻后，標記為染色工作液，用錫箔紙包裹，避免光照。然后進行下列操作。

• 小心加上xx微升染色工作液，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育30分鐘；或直至可見籃色
• 小心移去切片上的染色工作液 
• 室溫下，小心將切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A） 

三、 樣本顯色處理

實驗開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的顯色液（Reagent F）取出，加入xx毫升稀釋液（Reagent G），混勻，置入冰槽里；然后移取xx微升配制后的顯色液（Reagent F）和xx毫升反應液（Reagent H）到2.2毫升離心管，充分混勻，標記為顯色工作液，避免光照。  

• 小心加上xx微升封阻液（Reagent E）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育20分鐘
• 小心移去切片上的封阻液（Reagent E）
• 室溫下，小心將切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）（注意：須清洗干凈，否則影響下一步操作）
• 小心加上xx微升配制后的顯色液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育20分鐘，避免光照
• 小心移去切片上的顯色液（Reagent F）
• 小心加上xx微升顯色工作液在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育15分鐘，或直至肉眼可見棕黑色沉積，避免光照
• 小心移去切片上的顯色工作液 
• 室溫下，小心將切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在一般光學顯微鏡下觀察：三價鐵沉積陽性細胞呈現棕褐色 

注意事項

• 本產品為50次操作
• 操作時，須戴手套和防護面罩
• 建議在通風柜里操作
• 所有操作在室溫下進行
• 染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）具有腐蝕性和毒性，注意操作安全
• 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干。空氣中晾干狀態為沒有水滴，呈濕潤狀態，可見反光
• 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
• 樣品染色避免過度，肉眼可見棕色即可終止染色
• 配制后的顯色液（Reagent F）避免反復凍融
• 顯色工作液不能儲存后使用；如果發現沉淀，不宜使用
• 組織細胞染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察 
• 本公司提供系列組織細胞金屬元素染色試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定顯色清晰