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單層細胞傳代培養(yǎng)時常出現(xiàn)的問題

來源:賽諾利康生物技術(shù)(北京)有限公司   2020年06月05日 11:44  
1. 細胞難脫離
 
• 培養(yǎng)基內(nèi)含有某些抑制成分(例如血清)使細胞解離液失活。
 
解決對策:在加入細胞解離液(dissociating solution)之前,先用DPBS潤洗細胞兩次或者是直接用細胞解離液潤洗細胞。
 
• 選用的細胞解離液太弱。
 
解決對策:提高酶濃度、EDTA濃度,或者使用作用更強的細胞解離液(如dispase, collagenase),或者是把細胞置于37°C孵育以提高解離液的活性。
 
• 細胞達到100%匯合時間太久,細胞間連接變得非常牢固,阻礙了解離液滲透到細胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸的界面。
 
解決對策:當細胞達到大約70%-90%匯合時,即進行傳代。
 
2. 細胞脫離下來后聚集成團(Clumps)
 
• 分離過程太劇烈,導致細胞裂解釋放基因組DNA。原因有二:一,移液槍吹打太劇烈;第二,選用的細胞解離液太強或有毒性,導致pH或滲透壓異常。
 
解決對策:往細胞懸液內(nèi)加入一滴無菌DNAse (1 mg/ml in water)使DNA鏈斷裂。在隨后的操作中,注意溫和吹打細胞懸液,縮短孵育時間,換用弱一點的細胞解離液或者在低一點的溫度下孵育。
 
• 如果收集的單細胞懸液沒有立即加入培養(yǎng)基稀釋并接種到新的培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),而是在室溫放置一段時間。這種情況下,細胞也有可能會聚集成團。
 
解決對策:將細胞懸液放置在冰上。
 
• 細胞懸液離心去除多余解離液時,離心太劇烈或時間過久。
 
解決對策:確保溫和離心,推薦使用125g離心10 min。
 
3. 細胞重新貼壁困難
 
• 細胞解離過程持續(xù)時間過長,使得存在于細胞膜上的細胞附著所必需的蛋白剝離。
 
• 培養(yǎng)基內(nèi)缺少足夠的血清或黏附因子(常見于無血清培養(yǎng)基)。
 
解決對策:往培養(yǎng)基內(nèi)添加黏附因子或者選用蛋白(collagen, poly-L-lysine, fibronectin, gelatin, etc.)包被過的培養(yǎng)容器。
 
• 未失活細胞解離液或者離心去除細胞解離液。
 
解決對策:在培養(yǎng)基內(nèi)添加額外的血清或特異性酶抑制劑(例如,大豆胰蛋白酶抑制劑)中和細胞解離液。亦或使用125g離心5min去除細胞解離液,然后使用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞。
 
4. 細胞活力低
 
• 細胞分離過程太劇烈
 
解決對策:自行摸索解離時間。
 
• 配制細胞分離液所用的平衡鹽溶液(Balanced Salt Solution)pH或滲透壓異常。
 
解決對策:測量pH或滲透壓或直接換一瓶新的平衡鹽溶液。
 
• 在重新接種之前,單細胞懸液以非常高的細胞密度在室溫放置時間過長。
 
解決對策:將細胞懸液置于冰上。
 
• 培養(yǎng)基選擇不恰當。
 
解決對策:推薦使用與原代細胞相配套的專屬培養(yǎng)基。

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