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22rv1-LUC人前列腺癌熒光素酶標記細胞 培養步驟

來源:上海琛藝實業有限公司   2020年06月04日 15:26  

產品A名稱:22rv1-LUC人前列腺癌熒光素酶標記細胞 培養步驟已通過STR鑒定

中文名稱:22rv1-LUC人前列腺癌熒光素酶標記細胞 

規格:T25

形態特征:

生長狀態:成纖維細胞樣

特征特性:貼壁生長

培養條件:DMEM(高糖)+10%FBS(推薦BI優等胎牛血清貨號:04-001-1acs

傳代方法:消化3-5分鐘。1:2。3天內可長滿。

凍存條件無血清凍存液規格:100ML

支原體檢測:陰性

使用權限:A類

參考文獻:

供應商:上海琛藝實業有限公司

復蘇周期:10個工作日左右

 

培養步驟:

1)復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補加4-6mL*培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜(或將細胞懸液加入6cm皿中),培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養。

 

1、對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法:

1. 棄去培養上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養瓶中,置于37℃培養箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的*培養基終止消化。

3.輕輕吹打細胞,*脫落后吸出,在1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養液后吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補加培養液,將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。

· 細胞名稱: 22rv1-LUC人前列腺癌熒光素酶標記細胞 培養步驟已通過STR鑒定

· 組織  小鼠乳腺癌細胞系

· 母細胞來源  客戶

· 轉染方法與標記過程的描述 慢病毒轉染Hygromycin篩選 

1. 質粒部分

1.酶切載體:pGL4.10(luc2)由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷;EGFP和mCherry片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段;pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收:上述酶切產物DNA電泳,TAKARA試劑盒膠回收,回收產物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體,連接使用20ul體系,25℃,10min。

4.轉化:感受態菌One Shot Stbl3在冰上融化后,加入連接產物,靜置25min后在水浴42℃,45sec熱休克,后加入250ul無抗培養基225轉搖菌1h,將轉化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克隆:觀察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養基搖菌管中,255轉搖菌6.5h。

6.小抽質粒與鑒定:使用堿裂解法小抽,質粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解;酶切鑒定: 重組質粒用通過酶切鑒定。

7.熒光素表達鑒定: 重組質粒pSin-hyg-GFP/luc2(以下簡稱Gluc)或pSin-hyg-mCherry/luc2(以下簡稱Mluc) 轉染293T細胞:DNA定量后,使用PEI轉染Gluc或Mluc至24孔板已預鋪的293T細胞中。轉染采用脂質體法轉染,試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水,其中一管加入1ug量的質粒(DNA體積=1ug/DNA濃度),輕輕震蕩混勻,再輕微離心;在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻,輕微離心,然后把PEI管中的溶液加入含有的質粒管中,室溫孵育20min。將脂質體包繞DNA的混合液加入需要轉染的24孔內,37 ℃、5 % CO2條件下培養,8小時后換培養液。

8.報告基因檢測:Passive Lysis Agent裂解細胞,加入熒光素酶作用底物,將轉染質粒的細胞與陰性,陽性對照共同進行單報告基因檢測。

9.質粒中抽:取1ml轉染報告基因檢測正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養基中搖菌過夜,使用Invitrogen試劑盒中抽,產物電泳鑒定,-20℃保存。

1. 慢病毒包裝部分

1. 質粒共轉染細胞:轉染前一天,293T在10cm培養盤中的細胞達到90%,胰酶消化后,1:3傳入新10cm培養盤中。轉染時,細胞在培養盤中密度達到80%。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。

2.提取病毒上清:轉染48-72hours后,將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下,3000rpm,離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。

3.濃縮病毒:將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中,2000rpm,4℃,15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中,-80℃保存。

1. 慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1),消化4T1細胞并計數,將細胞鋪于24孔板中(以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度,37°C過夜孵化細胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液,并且制備1:2病毒稀釋液200µl加入細胞中。

3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml,晃勻孔板,37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基,加入500µl*培養基。

5.(Day4)換液,加入300µg/ml  Hygromycin(Sigma)來選擇穩定感染的細胞克隆。

6.(Day4-7),每24h換液,300µg/ml Hygromycin(Sigma)來選擇穩定感染的細胞克隆。

維持培養。

7.(Day8-12)細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養。

8. 4T1-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞,用Passive Lysis裂解液裂解,加入熒光素酶作用底物,將轉染質粒的細胞與陰性,陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。

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