A549/FU人肺癌氟尿嘧啶耐藥株細(xì)胞 培養(yǎng)步驟 含STR鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、A549/FU人肺癌氟尿嘧啶耐藥株說明書細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

注意事項

A549/FU人肺癌氟尿嘧啶耐藥株細(xì)胞 培養(yǎng)步驟 含STR鑒定

一，燒瓶培養(yǎng)的處理程序

在培養(yǎng)瓶中接種細(xì)胞并在培養(yǎng)基中*填充培養(yǎng)基以防止運(yùn)輸過程中細(xì)胞的丟失。

1、收到后，目視檢查培養(yǎng)物是否有微生物污染的宏觀證據(jù)。

使用倒置顯微鏡（配備有相位傳感器），仔細(xì)檢查是否有微生物污染的證據(jù)。還檢查以確定大多數(shù)細(xì)胞是否仍然附著在燒瓶底部？在運(yùn)輸過程中，培養(yǎng)物有時被粗略地處理，并且許多細(xì)胞經(jīng)常分離并懸浮在培養(yǎng)基中（但仍然是可行的）。

2、如果細(xì)胞仍然附著，無菌去除5至10毫升的運(yùn)輸介質(zhì)。可以節(jié)省運(yùn)輸媒介以重復(fù)使用。在5%℃的空氣中，在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞，直到它們準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.如果細(xì)胞沒有附著，無菌地移除燒瓶的全部內(nèi)容物，并以1000rpm離心5至10分鐘。取出運(yùn)輸介質(zhì)并保存。在10毫升這種培養(yǎng)基中重新沉淀顆粒細(xì)胞并加入25厘米的燒瓶中。在空氣中5%℃下，在37℃下孵育，直至細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

二、傳代程序

體積為75厘米的燒瓶。增加或減少其他尺寸培養(yǎng)容器所需的分離培養(yǎng)基的量。

1、去除和丟棄培養(yǎng)基。

2.用0.25%(w/v)胰蛋白酶0.53mM EDTA溶液沖洗細(xì)胞層，除去所有含有胰蛋白酶抑制劑的血清痕跡。

3.添加2.0~3.0 ml胰酶-EDTA溶液瓶中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞到細(xì)胞層分散（取決于胰蛋白酶的批）。

注意：為了避免結(jié)塊，不要在擊打或搖晃瓶子時攪拌細(xì)胞，等待細(xì)胞分離。難以分離的細(xì)胞可以放置在37°C以促進(jìn)擴(kuò)散。

4、加入6～8毫升的完整生長培養(yǎng)基，輕輕吸液，抽吸細(xì)胞。

5、在新培養(yǎng)容器中加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸液等分試樣。

6、培養(yǎng)37°C培養(yǎng)基。

推薦栽培比為1:3∶1:4。

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