MB10067.1 v.A

   活體細胞氧化應激活性氧超氧陰離子原位染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

   活體細胞氧化應激活性氧超氧陰離子原位染色試劑是一種旨在通過硝基藍四氮唑染料，受到超氧陰離子O₂^-的還原，產生不溶性藍黑*素沉淀，來定性檢測細胞內活性氧族的生成和增加的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），一旦受到超氧陰離子O₂^-的直接還原，便產生不溶性甲暨色素。據此證明細胞內超氧陰離子活性氧族的存在。 

產品內容

   染色液（Reagent A）     毫升

   清理液（Reagent B）     毫升

產品說明書     1份

保存方式

保存   染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

*細胞培養液（GMS12052）：用于細胞操作所需的培養基

細胞培養箱：用于細胞染色孵育

光學顯微鏡：用于觀察染色細胞

實驗步驟

• 準備好待測的細胞培養板的培養細胞
• 直至細胞鋪滿率達70％
• 小心抽掉多孔細胞培養板里的培養液
• 小心加入適量的用戶自備的細胞培養液以及處理藥品到每個培養孔里（見下表）

• 加入適量的   染色液（Reagent A）到每個培養孔里（見下表）

• 輕輕搖動細胞培養板，混勻
• 放進37℃細胞培養箱里孵育60分鐘
• 小心抽去培養液
• 小心加入適量的   清理液（Reagent B）（見下表）

• 小心抽去清理液
• 重復實驗步驟9和10二次
• 小心加入適量的   清理液（Reagent B）（見上表）
• 即刻置于光學顯微鏡下觀察：細胞呈現藍黑色，顯示ROS增強
• （選擇步驟）倒置培養板在紙巾上，使其吸干培養孔里的殘存液體
• （選擇步驟）用封口膜密封培養板，在室溫下長時間保存
• （選擇步驟）如果重新啟封觀察，發現樣本干枯或收縮，只需加上適量的無離子水則可

注意事項

• 本產品為100次（96孔板）操作
• 細胞培養操作，須無菌狀態下進行
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，須避免光照
• 建議96孔細胞培養板中每孔待測細胞密度為10⁴細胞
• 細胞染色前后的清洗過程中，小心操作，以免將細胞沖洗掉
• 本產品適合載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿等操作，按照6孔細胞培養板用量操作
• 如果超氧陰離子活性氧濃度過低，可以延長孵育時間至4小時
• 建議細胞染色完成后，即刻進行細胞觀察分析
• 本公司提供系列細胞活性氧檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定顯色清晰