MB50083 v.A

 線粒體呼吸鏈復(fù)合物V活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 線粒體呼吸鏈復(fù)合物V（F0F1-ATP酶/ATP合成酶）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定與ATP合成對應(yīng)的ATP水解產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法測定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動物、人體、酵母）以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣品的F0F1-ATP酶/ATP合成酶的特異性活性檢測。可用于心肌、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

線粒體呼吸鏈復(fù)合物V，通常稱為ATP合成酶（ATP synthase）、F型ATP酶（F type ATPase）和F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase），是線粒體氧化磷酸化的*反應(yīng)。其分子量為500KD，含有十六個亞單位，其中兩個：ATP酶6和8為線粒體DNA編碼的。ATP酶主要有兩個結(jié)構(gòu)域：F0為質(zhì)子通道，由幾個膜蛋白構(gòu)成，包括a、b、c、d、e、F6、A6L、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和F1催化活性結(jié)構(gòu)域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構(gòu)成。其特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。復(fù)合物V的主要功能在于產(chǎn)生大部分細(xì)胞所需的能量ATP。ATP的合成需要線粒體內(nèi)膜電子傳遞到氧分子時，呼吸鏈蛋白所產(chǎn)生的質(zhì)子梯度變化。質(zhì)子通過F0結(jié)構(gòu)域傳遞到基質(zhì)，激活F1催化活性結(jié)構(gòu)域，促使ATP合成。該酶異常會導(dǎo)致心肌和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。基于ATP，在寡霉素參與下，受到F1F0 ATP酶的水解，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析F1F0 ATP酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

F1F0 ATPase

 ATP   =    ADP  +  Pi

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

  （高吸收峰） （低吸收峰）

產(chǎn)品內(nèi)容

 緩沖液（Reagent A）  20毫升

 反應(yīng)液（Reagent B）      2.5毫升

 陰性液（Reagent C）     2毫升

 底物液（Reagent D） 500微升

 專性液（Reagent E）   250微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融； 反應(yīng)液（Reagent B），避免光照，有效保證6月

用戶自備

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化； 反應(yīng)液（Reagent B）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔30秒，讀數(shù)11次（共5分鐘），并置零
•  緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入100微升 陰性液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘

• 樣品總活性測定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘

• 樣品非特異活性測定

實驗開始前，移取100微升待測樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）到1.5毫升離心管，加入20微升 專性液（Reagent E），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

• 移取760微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入120微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘

• 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) X 1或5（反應(yīng)時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘

2）樣品特異活性

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

注意事項

• 本產(chǎn)品為21次操作（10個樣本），包括1次背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 線粒體樣品檢測前，建議凍存融解（－70℃至37℃）循環(huán)3次
• 如果增強(qiáng)酶活檢測，建議使用 線粒體復(fù)合物待測樣品預(yù)處理試劑盒－GMS10342
• 建議線粒體懸液使用0.25 M SUCROSE和2 mM EDTA，pH9.0；忌用磷酸緩沖溶液
• 建議使用線粒體裂解懸液，而不是細(xì)胞裂解懸液。如果使用細(xì)胞裂解懸液，*須澄清；第二須加50微克
• 加入樣品后3秒內(nèi)即刻光度測定
• 反應(yīng)1分鐘后光度測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)5分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于1分鐘或5分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本線粒體蛋白濃度為10微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供 線粒體溶解試劑盒GMS10018為后續(xù)的線粒體蛋白濃度測定的預(yù)處理試劑盒和  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 樣品特異活性是指寡霉素敏感的ATP合成酶，去除其它干擾因素（例如復(fù)合物I/II/III/IV等）
• 線粒體呼吸鏈復(fù)合物V酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確