細胞血管緊張素Ⅰ轉化酶2（ACE2）活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

  細胞血管緊張素Ⅰ轉化酶2（ACE2）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過三肽化合物底物FAPGG，在血管緊張素Ⅰ轉化酶1抑制劑的存在下，受到血管緊張素Ⅰ轉化酶2的水解，釋放出FAP，產生吸收峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體、昆蟲等）血管緊張素Ⅰ轉化酶2（ACE2）的特異活性檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，具有高通量、自動化操作的優點。

技術背景

血管緊張素Ⅰ轉化酶（angiotensin I-converting enzyme；ACE；EC3.4.15.1），又稱為肽基二肽酶A（peptidyl dipeptidase A）、羧基組織蛋白酶（carboxycathepsin）或激肽酶II（kininase II），是一種體細胞類150至180KD、生殖細胞類90至110KD的多肽外切酶（exopeptidase）和鋅金屬肽酶（zinc metallopeptidase）。血管緊張素Ⅰ轉化酶有2種同工酶：1型和2型，其間80至90%同源。I型主要存在于肺毛細管細胞內，也在血管內皮細胞、腎上皮細胞和睪丸leydig細胞膜中表達；II型主要存在于心臟和腎臟血管內皮細胞膜上。ACE在腎素-血管緊張素-醛固酮（aldosterone）系統中發揮重要作用。作為血管收縮劑（vasoconstrictor），ACE催化十肽血管緊張素I的C末端的組胺酰亮氨酸（histidylleucine）二肽的切離水解反應，轉化為血管緊張素II；同時作為血管擴張劑（vasodilator），ACE使緩激肽（bradykinin）失活。ACE常用于藥物靶標，治療高血壓（例如噻嗪化物thiazide）、心力衰竭（例如利尿靈furosemide）、糖尿病腎病和SARS等疾患。基于人工合成的三肽化合物底物呋喃基丙烯酰苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanylglycylglycine；FAPGG），在血管緊張素Ⅰ轉化酶1抑制劑甲羥孕酮醋酸酯（Foroxymithine）的存在下，受到血管緊張素Ⅰ轉化酶2的水解，釋放出呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（furylacryloylphenylalanine；FAP）和雙甘氨肽（glycylglycine），產生吸收峰值的變化，在分光光度儀（340nm 波長）下，來定量測定血管緊張素Ⅰ轉化酶2的特異活性。血管緊張素Ⅰ轉化酶2反應系統為：

ACE2

FAPGG   →  Furylacryloylphenylalanine  +  glycylglycine

    Foroxymithine

產品內容

  清理液（Reagent A） 120毫升

  裂解液（Reagent B）  15毫升

  緩沖液（Reagent C）   5毫升

  陰性液（Reagent D）     1毫升

  底物液（Reagent E）     1毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent E）避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

超速離心管：用于樣品離心的容器

臺式離心機：用于樣品沉淀

4℃超速離心機：用于分離膜蛋白成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

超聲儀：用于裂解樣品

培養箱：用于反應物孵育

96孔板或200微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

• 樣品制備

• 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）
• 小心加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的500微升  裂解液（Reagent B） 
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下） 
• 將所有細胞勻漿物移入1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的超速離心管，轉至步驟18
• 加入200微升  裂解液（Reagent B），混勻沉淀顆粒
• 超聲處理：200瓦，50%功率，5秒一次，間隔3分鐘，重復2次——此步驟獲得粗提總蛋白
• （選擇步驟）放進上述超速離心管到4℃超速離心機離心30分鐘，速度為40000g
• （選擇步驟）小心移出上清液到到預冷的1.5毫升離心管——此步驟獲得膜蛋白
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好藥物處理的待測樣品
• 設定好酶標儀（溫度為37℃）：波長340nm，間隔5分鐘，讀數6次（共30分鐘），并置零或0分鐘和30分鐘各測讀1次，并置零
• 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照

• 活性測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取180微升  緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入50微升  底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育15分鐘
• 分別加入20微升  陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（100微克總蛋白或50微克膜蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板（限定在10秒之內）
• 即刻放進37℃預熱的酶標儀檢測或轉移到200微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 獲得吸光讀數：0分鐘讀數－30分鐘讀數
• 活性計算：

• 酶標儀檢測

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 0.758（毫摩爾吸光系數）X 30 （反應時間；分鐘）X 0.6 （光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾FAP/分鐘

• 比色皿檢測

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 0.758（毫摩爾吸光系數）X 30 （反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾FAP/分鐘

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融
• 樣品避免使用EDTA和EGTA等處理
• 加樣后10秒內比色測定
• 測定值由高到低變化；測定持續30分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣品0分鐘讀數通常和背景空對照0分鐘讀數一致，約為1.5左右
• 樣本測定30分鐘讀數低于0分鐘讀數，即讀數下降，表明具有酶活性
• 建議待測樣本為總蛋白，其濃度為100微克/20微升；待測樣本為膜蛋白，其濃度為50微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 可以使用血管緊張素Ⅰ轉化酶2抑制劑DX600（IC50=10微摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• 血管緊張素Ⅰ轉化酶2單位活性定義為：在37℃，pH 8.3條件下，每分鐘內能夠產生1微摩爾呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（Furylacryloylphenylalanine）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列血管緊張素Ⅰ轉化酶學檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感