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細胞爬片制備詳細過程

來源:上海聯碩生物科技有限公司   2020年04月10日 13:49  

一、爬片的準備

1.爬片可用一般的蓋玻片,也可用爬片;

2.應用蓋玻片,可根據自己的需要剪裁成合適的大小,以備置于6孔板、12孔板或24孔板;裁剪時可用前護士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪,或者是口腔科的那種小沙輪,輕輕劃一下后,稍用力一掰就分開了。

如果接種大皿的話,我一般不將蓋玻片切開,直接清潔后放入培養皿中,到染色時再將之切開,這樣既保證了細胞均一性,又可同時做幾個指標的染色。

3.將剪裁好的爬片,置于濃硫酸中浸泡并過夜,第二天先用自來水沖洗20遍,再置于無水酒清中浸泡6小時,再用三蒸水沖洗3遍,放在飯盒或者玻璃培養皿中烘干后進行高壓消毒。

4.高壓后取出放入烤箱中烤干,備用。烤干后可放入超凈臺中。

5.關于多聚賴氨酸,很多人都將玻片用此處理,以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸,細胞貼壁仍然很好,且在做后續的免疫細胞化學染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。

 

二、細胞爬片 

1.胰酶消化細胞后計數重懸細胞于*培養基中。

2.加細胞時,根據玻片的大小,先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養基,目的是使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細胞懸液時玻片漂起,造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作。

3.根據自己的需要選擇合適的細胞密度種入培養板內即可

4.待細胞貼壁后,可去上清加含藥培養基。

5.按照實驗設計,作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養皿底結合較緊,張力較大,我一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,48h,72h等這樣時間點的實驗的話,將所需數量的爬片取出時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續培養。

 

三、細胞爬片的固定

細胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后再做固定。當然,根據研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗,因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會脫落。

另外在保存細胞爬片的時候,我一般用培養皿或板,先在皿底放一層面巾紙,然后再放爬片,這樣方便做實驗時取片。然后蓋上蓋子,并在蓋子上做標記,為避免混淆,可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。

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