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TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)，全內反射熒光顯微鏡，利用光從高折射率的介質進入較低折射率的介質時，如果入射角足夠大時則光全部被反射而不發生折射，但是在兩種介質的界面會產生衰逝波可以激發近界面100nm范圍內的熒光的原理來實現對物體表面的觀察。可通過常規熒光顯微鏡的照明器或特殊照明器送入激發光，并對激光的入射角度進行控制，采用瞬間場激發方法以避免激發光進入探測器，在玻璃和水界面的激發光產生全內反射實現的。因為激發光呈指數衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區域會產生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測標的，故此項技術廣泛應用于細胞表面物質的動態觀察。
全內反射熒光顯微鏡 (TIRFM)示意圖
①樣品 ②損耗波范圍 ③蓋玻片 ④浸鏡油 ⑤目標 ⑥發射光束(信號) ⑦激發光束
為了實現全內反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。這可以通過棱鏡(prism)實現，稱為棱鏡型TIRFM(prism-based TIRFM)，也可通過高數值孔徑的物鏡實現，此時稱為物鏡型TIRFM(objective-type TIRFM)。現在商品化的全內反射熒光顯微鏡一般都是物鏡類型的，速度快，精度高。
全內反射熒光顯微鏡由于能實現物體表面非常薄范圍內(小于100nm)熒光觀察，故在某些生物領域得到廣泛應用。如以下等應用：
細胞表面圖象的觀察：細胞膜表面結構、細胞表層的接觸、膜表面動力學/蛋白質定位。
單分子觀察及其操作：肌球蛋白、肌動蛋白與Cy3標記ATP。
細胞膜表面運動：如泡吞、泡吐現象，泡外分泌現象。
細胞膜鈣火花現象的觀察，離子通道監視。
分子馬達研究：旋轉的馬達、細胞骨架蛋白、聚合體、G蛋白、環狀蛋白、核苷酸馬達。
除了在生物領域外，在化學領域等對于化學分子結構觀察中也有很好的應用。
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