基本PCR運行可以分為三個階段:指數期、線性期和平臺期,熒光定量PCR儀主要是在發生PCR擴增時進行測量。一般為定量,因為在PCR的指數(對數)期內采集數據,在此期間PCR產物的數量與核酸模板的量成正比。
熒光定量PCR儀的應用十分廣泛,可以進行基因表達定量、芯片驗證、病原體檢測、SNP基因分型、拷貝數變異、microRNA分析、病毒定量、siRNA/RNAi實驗多種方向的研究測量。
1、提高檢測的動態范圍
2、無需PCR后處理
3、檢測能夠覆蓋低至2倍的變化
4、在PCR的指數期內采集數據
5、報告基團熒光信號的增加與生成的擴增子數量成正比
6、裂解探針提供擴增子的裂解記錄
熒光定量PCR儀集中于指數期,因為它可提供更加精確的數據進行定量。在指數期內,實時計算兩個數值。閾值線是反應的熒光強度超過背景時的檢測水平。樣品達到此水平的PCR循環稱為循環閾值(Ct)。Ct值用于下游定量或存在/缺失檢測。通過比較未知濃度的樣品與一系列標準品的Ct值,可以精確測定未知反應中的模板DNA數量。
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