組織甘油激酶(Glycerol kinase)活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量
MB50379.2 v.A
組織甘油激酶(Glycerol kinase)活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒
產(chǎn)品說明書(中文版)
主要用途
組織甘油激酶(Glycerol kinase)活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用甘油激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化后吸光峰值的降低,即采用光譜法測定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物、人體組織裂解懸液樣品的甘油激酶的性活性檢測。可用于脂類代謝、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶,嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,反應(yīng)優(yōu)化,檢測敏感。
技術(shù)背景
甘油激酶(glycerol kinase;GK;EC2.7.1.30),又稱為ATP甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶(ATP:glycerol 3-phospho transferase),廣泛存在于生物界。甘油激酶催化由ATP提供的磷酸基團(tuán),轉(zhuǎn)移到甘油分子上的反應(yīng),產(chǎn)生磷酸甘油。哺乳動物中,甘油激酶參與糖和脂類代謝的交接部位的反應(yīng);微生物中,甘油激酶幫助利用甘油分子,作為微生物生長所需的碳源。臨床上常用于定量檢測人體內(nèi)甘油水平。通常脂肪細(xì)胞(adipocyte)缺乏甘油激酶,由甘油三酯降解產(chǎn)生的甘油分子,由血液轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟后,甘油激酶參與脂類分解(lipolysis)。基于底物甘油分子,在ATP的參與下,受到甘油激酶的磷酸化,進(jìn)而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase;LDH)反應(yīng)系統(tǒng)中,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),產(chǎn)生的吸光峰值的變化(340nm),來定量分析甘油激酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為:
glycerol kinase
Glycerol + ATP → ADP + α-glycerophosphate
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
(高吸收峰) (低吸收峰)
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 60毫升
裂解液(Reagent B) 10毫升
緩沖液(Reagent C) 20毫升
反應(yīng)液(Reagent D) 2.5毫升
陰性液(Reagent E) 2毫升
底物液(Reagent F) 500微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存 清理液(Reagent A)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融; 反應(yīng)液(Reagent D),避免光照,有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
(微型)臺式離心機(jī):用于樣品操作
比色皿:用于光譜分析的容器
分光光度儀:用于光譜分析
培養(yǎng)箱:用于孵育反應(yīng)物
實驗步驟
實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化; 反應(yīng)液(Reagent D)注意避光。然后進(jìn)行下列操作。
- 樣品準(zhǔn)備
- 手術(shù)取出動物組織,并秤重以確定500毫克組織重量
- (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- (選擇步驟)加入3毫升 清理液(Reagent A)清洗1次
- 移入到一個液氮凍存管
- 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
- 次日從液氮罐里取出,即刻(*速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融)
- 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
- 加入預(yù)冷的500微升 裂解液(Reagent B)
- 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒,充分混勻
- 置于冰槽里孵育30分鐘,期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒(注意:如需暫時停止,放進(jìn)-70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>)
- 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
- 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒- MB30030.1)
- 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準(zhǔn)備
- 準(zhǔn)備好待測樣品,置于冰槽里
- 設(shè)定好分光光度儀(溫度為25℃):波長為340nm,間隔1分鐘,讀數(shù)11次(共10分鐘),并置零
- 緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度
- 背景對照測定
- 移取780微升 緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入100微升 反應(yīng)液(Reagent D)
- 加入20微升 底物液(Reagent F)
- 放進(jìn)25℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
- 加入100微升 陰性液(Reagent E)
- 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為背景空對照:340波長讀數(shù)0分鐘 -340波長讀數(shù)10分鐘
- 樣品活性測定
- 移取780微升 緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入100微升 反應(yīng)液(Reagent D)
- 加入20微升 底物液(Reagent F)
- 放進(jìn)25℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
- 加入100微升待測樣品(注意:100微克總蛋白)
- 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為樣品活性讀數(shù):340波長讀數(shù)0分鐘 -340波長讀數(shù)10分鐘
- 計算樣品活性
【(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X 1(體系容量;毫升)X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.1(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù) X 10(反應(yīng)時間;分鐘)】=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾NADH/分鐘
- 酶標(biāo)板測定
- 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對照和樣品
- 分別移取195微升 緩沖液(Reagent C)到96孔板中的所有孔中
- 分別加入25微升 反應(yīng)液(Reagent D)
- 分別加入5微升 底物液(Reagent F)
- 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
- 在25℃溫度下孵育3分鐘
- 分別加入25微升 陰性液(Reagent E)或待測樣品(20微克蛋白)到相應(yīng)孔中(注意:樣品須清澈)
- 輕輕搖動酶標(biāo)板
- 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測:獲得吸光讀數(shù)
- 活性計算
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25(體系容量;毫升)]÷[0.025(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 0.6(光徑距離;厘米)X 10(反應(yīng)時間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾NADH/分鐘
注意事項
- 本產(chǎn)品為21次操作,包括1次背景對照
- 操作時,須戴手套
- 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1次
- 避免使用磷酸緩沖溶液處理樣品
- 加入樣品后3秒內(nèi)即刻光譜測定
- 初始反應(yīng)可能較為遲緩;測定值由高到低變化;測定可以持續(xù)10分鐘
- 測定值由高到低變化,即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘測定讀數(shù),表明有酶活性
- 光譜測定后,比色皿須清洗*
- 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/100微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量;注意計算公式的調(diào)整(本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 MB30030.1)
- 甘油激酶活性單位定義:在25℃溫度下,pH 8.9條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列激酶類技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確
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