mb50353.1 v.A

 細胞逆轉錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞逆轉錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉錄酶的催化，聚合產生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子，由PicoGreen特異染色，即采用熒光法來測定細胞裂解樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）逆轉錄酶的活性，以及抑制劑檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

逆轉錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE；EC2.7.7.49），又稱為RNA依賴性DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase），是將單鏈RNA分子轉錄為雙鏈DNA的DNA聚合酶，包括HIV逆轉錄酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus；MMLV）逆轉錄酶、禽類成髓細胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus；AMV）逆轉錄酶、端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase） 等。逆轉錄病毒使用逆轉錄酶達到逆轉錄RNA為DNA，然后整合到宿主基因組再復制。在真核生物中，端粒酶是一種逆轉錄酶。逆轉錄酶在分子生物學中得到廣泛運用。檢測逆轉錄酶活性成為病毒感染的監測手段，同時作為藥物篩選的靶標。基于由poly-A模板與oligo-dT引物構成的雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉錄酶的催化，聚合產生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子（heteroduplexes），由PicoGreen特異染色，根據熒光強度分析（激發波長480nm，散發波長520nm），來定量測定逆轉錄酶的活性。 

產品內容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 底物液（Reagent D） 微升

 終止液（Reagent E） 微升

 染色液（Reagent F） 微升

 稀釋液（Reagent G） 毫升

 標準液（Reagent H） 微升

產品說明書    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里； 染色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或酶標板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

• 樣品準備

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入置于冰槽里的xx微升 裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－ MB30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設定好熒光酶標儀（溫度為25℃）：激發波長490nm，散發波長520nm
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升 裂解液（Reagent B）到1至5號管
• 移取xx微升 標準液（Reagent H）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管稀釋的 標準液（Reagent H）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的 標準液（Reagent H）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的 標準液（Reagent H）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

三、標準曲線構建

測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升 稀釋液（Reagent G），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為 反應工作液（注意：5次操作量），放在暗室里備用。然后進行下列操作

• 在96孔板上做好相應標記：標準樣品
• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板的對應孔里
• 分別加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 分別加入5微升上述配制的標準液
• 分別加入xx微升 終止液（Reagent E）
• 分別加入xx微升 染色工作液
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 實際熒光讀數：標準樣品相對熒光讀數－5號管標準樣品相對熒光讀數（作為背景空對照）
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為實際熒光單位RFU；橫座標（X軸）為標準DNA濃度（納克/毫升）

四、樣品測定

測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升 稀釋液（Reagent G），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為 反應工作液（注意：5次操作量），放在暗室里備用。然后進行下列操作

• 在96孔板上做好相應標記：待測樣品
• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板的對應孔里
• 加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 加入5微升待測樣品（注意：10微克純化酶蛋白或50微克裂解懸液蛋白）
• 室溫下孵育60分鐘
• 分別加入xx微升 終止液（Reagent E）
• 分別加入xx微升 染色工作液
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 實際熒光讀數：待測樣品相對熒光讀數－5號管標準樣品相對熒光讀數（作為背景空對照）
• 根據標準曲線獲得樣品對應DNA濃度（納克/毫升）
• 實際活性計算：

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準曲線測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要
• 樣品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100等
• 反應完成后即刻進行熒光測定
• 測定值由低到高變化
• 樣本測定樣品讀數高于背景讀數表明具有酶活性
• 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為10微克/5微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒 MB30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 逆轉錄酶單位活性定義為：在25℃，pH 8.1條件下，每小時內能夠轉錄1納克DNA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列逆轉錄酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感