神經突觸體（synaptosome）高純分離試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 神經突觸體（synaptosome）高純分離試劑是一種旨在從動物神經細胞或組織中分離出完整而高度純化的突觸體細胞器的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于動物腦組織（包括腦皮質、紋狀體、海馬等）和培養神經細胞的活性突觸體的高純制備。其制備物產量高，可以被用于神經傳導介質、信號傳遞、蛋白組學和神經性疾病的病理生理學等的研究。產品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩定，分離產量和純度俱佳。

技術背景

突觸體（synaptosome），又稱為純化的神經末端（nerve terminals），源自于神經軸突（axons）和突觸后連接（postsynaptic connections），內含有細胞漿、突觸囊泡（synaptic vesicle；SV）、突觸后致密區（postsynaptic density；PSD）、線粒體和細胞骨架等結構，其具有生產ATP，具備功能性離子通道、載體和受體，維持膜電位和離子內平衡、攝取和釋放神經傳導介質（neurotransmitters），胞飲（endosytosis）等功能。突觸體成為腦組織中突觸功能分子機制研究的模型系統，以提供足夠的蛋白生化材料，識別主要的神經傳導介質及其代謝活性、攝取和釋放機制，發現突觸傳導調節信號通路，包括學習、記憶、感覺整合、運動調度和情緒反應等，研究突觸功能異常與衰老和神經性疾病的相關性。突觸體細胞器的分離是現代細胞生物學研究的*的手段之一。從腦組織或神經細胞分離突觸體的技術方法基本上采用：*，通過機械方法破裂組織細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑、巨大細胞器（細胞核），剝離神經末端部分，且重新封口，形成膜性液囊（sac）；第三，通過高速差速離心獲得突觸體、質膜、髓磷脂（myelin）、內質網、突觸體外線粒體；甚至第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的突觸體，去除髓磷脂（myelin）和突觸體外線粒體等。 

產品內容

 清理液（Reagent A）    毫升

 裂解液（Reagent B）    毫升

 活性液（Reagent C）    微升

 高純液A（Reagent D1）    毫升

 高純液B（Reagent D2）    毫升

 高純液C（Reagent D3）    毫升

 高純液D（Reagent D4）    毫升

 保存液（Reagent E）    毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存 裂解液（Reagent B）和 活性液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

*細胞培養液（GMS12052）：用于細胞處理所需的培養基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃臺式離心機：用于樣品操作

4℃超速離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細胞

實驗步驟

• 組織突觸體分離

• 手術取出動物腦組織，并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的 裂解液（Reagent B）
• 加入xx微升 活性液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 移取xx毫升的 高純液A（Reagent D1）到10毫升超速離心管（注意：使用前搖勻 高純液A(Reagent D1)）
• 移取xx毫升的 高純液B（Reagent D2）在 高純液A（Reagent D1）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻 高純液B(Reagent D2)）
• 移取xx毫升的 高純液C（Reagent D3）在 高純液B（Reagent D2）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻 高純液C(Reagent D3)）
• 移取xx毫升的 高純液D（Reagent D4）在 高純液C（Reagent D3）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻 高純液D(Reagent D4)）
• 輕輕加入xx毫升神經突觸體粗提掖在 高純液D（Reagent D4）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心5分鐘，速度為31000g
• 小心取出超速離心管：可見 高純液C（Reagent D3）和 高純液D（Reagent D4）交接處的樣品帶（注意：下1/5；見下圖） 

• 小心抽去樣品帶以上的液體
• 小心收集下1/5樣品帶到15毫升錐形離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純突觸體樣品
• 加入xx毫升 保存液（Reagent E）
• 放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入x微升 保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

二、細胞突觸體分離

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的 裂解液（Reagent B）
• 加入xx微升 活性液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 移取xx毫升的 高純液A（Reagent D1）到10毫升超速離心管（注意：使用前搖勻 高純液A(Reagent D1)）
• 移取xx毫升的 高純液B（Reagent D2）在 高純液A（Reagent D1）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻 高純液B(Reagent D2)）
• 移取xx毫升的 高純液C（Reagent D3）在 高純液B（Reagent D2）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻 高純液C(Reagent D3)）
• 移取xx毫升的 高純液D（Reagent D4）在 高純液C（Reagent D3）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻 高純液D(Reagent D4)）
• 輕輕加入xx毫升神經突觸體粗提掖在 高純液D（Reagent D4）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心5分鐘，速度為31000g
• 小心取出超速離心管：可見 高純液C（Reagent D3）和 高純液D（Reagent D4）交接處的樣品帶（注意：下1/5；見下圖） 

• 小心抽去樣品帶以上的液體
• 小心收集下1/5樣品帶到15毫升錐形離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純突觸體樣品
• 加入xx毫升 保存液（Reagent E）
• 放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

注意事項

• 本產品為10次（1克動物組織或5 X 10⁷細胞）操作
• 所有操作均須嚴格在4℃或以下狀態進行
• 操作時，須戴手套
• 操作時，須嚴格無菌操作，避免污染母液 
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數為20至40下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
• 通常1克動物腦組織或5 X 10⁷細胞的突觸體含量為2至4毫克以上突觸體蛋白

9． 本產品所獲得的突觸體純度（可達到99％）和產量*理想

10． 使用 高純液（Reagent D）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液

• 根據超速離心管的大小調整 高純液（Reagent D）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 本公司提供系列突觸體分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定分離的突觸體結構完整
• 本產品經鑒定分離的突觸體維持正常活性
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶