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AxyPrep 無內毒素質粒大量試劑盒

來源:上海研謹生物科技有限公司   2019年10月31日 17:33  

 

 

 

AxyPrep 無內毒素質粒大量試劑盒

 

本試劑盒采用 SDS 堿裂解法,結合DNA制備膜選擇性吸附DNA。同時采用特殊溶液(Buffer ETRBuffer PF)有效去除內毒素,可從 80-200 ml 細菌培養物中提取出多至 500 高純度質粒DNA,其內毒素水平控制在0.1 EU/以下。

 

一、 試劑盒組成、貯存、穩定性

 

 

Cat. No.

AP-MX-EP-2

AP-MX-EP-10

AP-MX-EP-25

 

制備次數

2 preps

10 preps

25 preps

 

制備管(Maxiprep column

 

2

 

10

 

25

 

大量濾器(Maxiprep syringe filter

 

2

 

10

 

25

 

RNase A

48 µl

270 µl

700 µl

 

Buffer S1

24

ml

115

ml

285

ml

 

Buffer S2

24

ml

115

ml

285

ml

 

Buffer S3K

24

ml

115

ml

285

ml

 

Buffer B

24

ml

115

ml

285

ml

 

Buffer W1

3

ml

160

ml

350

ml

 

Buffer W2 concentrate

15

ml

66

ml

150

ml

 

ET-free water (70% Ethanol)

1.8

ml

7.5

ml

18

ml

 

Eluent A

8

ml

30

ml

70

ml

 

Buffer ETR

10

ml

50

ml

120

ml

 

Buffer PF

3

ml

13

ml

30

ml

 

說明書

 

1

 

1

 

1

 

 

RNase A50 mg/ml,室溫可貯存 6 個月,長期貯存于-20℃。

 

Buffer S1:細菌懸浮液。加入 RNase A 后,混合均勻,4℃貯存。

 

Buffer S2:細菌裂解液(含 SDS/NaOH),室溫密閉貯存。

 

Buffer S3K:中和液,室溫密閉貯存。

 

Buffer BDNA 結合溶液,室溫密閉貯存。

 

Buffer W1:洗滌液,室溫密閉貯存。

 

Buffer W2 concentrate:去鹽液。使用前,按試劑瓶上的體積加入無水乙醇(可用無水乙醇或 95%乙醇)。混合均勻,室溫密閉貯存。

 

ET-free water (70% Ethanol):使用前,按試劑瓶上的體積加入無水乙醇(可用無水乙醇或 95%乙醇)。混合均勻,室溫密閉貯存。

Eluent A:洗脫液。室溫密閉貯存。

 

Buffer ETR:內毒素去除液。室溫密閉貯存。

 

Buffer PF:分相緩沖液。室溫密閉貯存。

二、 注意事項

細菌過量將影響細菌裂解、質粒 DNA 的釋放,導致內毒素含量過高。

步驟 3 和步驟 4 的操作必須溫和。劇烈搖晃將導致基因組 DNA 的污染。但混合必須充分,否則影響得率。

在加入 Buffer S3K 時,蛋白質和基因組 DNA 形成粘稠的白色絮狀沉淀,必須充分混合均勻,使凝集塊中間也得到充分中和凝結。

Buffer S2Buffer S3KBuffer B  Buffer W1 含刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套和防護眼鏡,避免沾染皮膚、眼睛和衣物,謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時,要立即用大量清水或生理鹽水沖洗,必要時尋求醫療咨詢。

三、 實驗準備

次使用前,RNase A 全部加入 Buffer S1 中,4℃貯存。

次使用前,Buffer W2 concentrate 中加入體積的無水乙醇。

次使用前,ET-free water (70% Ethanol)中加入體積的無水乙醇。使用前置于-20℃預冷。

使用前,檢查 Buffer S2 是否出現沉淀,如出現沉淀,應于 37℃溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后使用。

Eluent A  65℃預熱后使用,有利于提高質粒得率。

Buffer S3KBuffer B  Buffer ETR 使用前置于 4℃預冷。

準備無核酸和核酸酶污染的 Tip 頭、50ml 離心管。

水平離心機(轉速可達到 4,000×g)及冷凍離心機(轉速可達到 8,000×g

準備 56℃水浴。

四、 操作步驟

  • 80-200 ml 在 LB 培養基中培養過夜的菌液(若使用豐富培養基,菌液體積應減半或更少),3,000 ×g 離心 8 min,棄上清。將離心管倒置于紙巾上 1 min,除盡上清。
    • 一般過夜培養的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之間。若菌液 OD600 >4,菌量需減少。

10 ml Buffer S1懸浮細菌沉淀,懸浮需均勻,不應留有小的菌塊。

確認 Buffer S1 中已加入 RNase A

  • 10 ml Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過 5 min
    • Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH,降低溶菌效率。

避免劇烈搖晃,否則將導致基因組 DNA 污染。

此步驟不宜超過 5 min

  • 10 ml 4℃預冷的 Buffer S3K,溫和并充分地上下翻轉混合,直至溶液顏色均一并形成緊實的凝集塊,室溫放置 5 min
  • 加入 Buffer S3K 后應立即混合,以避免形成局部的凝結塊。

避免劇烈搖晃,否則將導致基因組 DNA 污染。

 

5.10 ml 4℃預冷的 Buffer B,溫和并充分地上下翻轉混合 10 次,8,000×g 離心(4℃)10 min

 

步驟 6-9 可以選擇離心法或負壓法。

 

  • 離心法:

 

6A. 先將大量制備管放入 50 ml 離心管中。吸取步驟 5 中的混合液,轉移到大量濾器Maxiprepsyringe filter中。

7A. 插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,6,000×g 離心 5 min 8A. 棄濾液,加 12 ml Buffer W1 至制備管中,6,000×g 離心 5 min

9A. 棄濾液,加 14 ml Buffer W2 至制備管中,6,000×g 離心 5 min

 

  • 確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。
  • 負壓法:

 

6B. 正確連接負壓裝置,將大量制備管插到負壓裝置的插口上。

7B. 吸取步驟 5 中的上清液,轉移到大量濾器中,插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,開啟并調節負壓至-25 ~ -30 英寸汞柱,緩慢吸走管中溶液。

8B. 保持負壓,加 12 ml Buffer W1,吸盡管中溶液。

9B. 保持負壓,加 14 ml Buffer W2,吸盡管中溶液。

確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。

再在大量制備管中加 4 ml Buffer W26,000×g 離心 5 min

將制備管置于另一潔凈 50 ml 離心管中,在制備管膜中央加 2 ml Eluent A,室溫靜置 5 min6,000×g 離心 5 min 收集質粒 DNA

Eluent A 加熱至 65℃將提高洗脫效率。

棄制備管。在濾液中加入 4 ml 預冷的 Buffer ETR,混合均勻。

如果 Buffer ETR 渾濁,于冰上靜置,直至溶液變得清亮;如果分層,則混合均勻。

加入 1 ml Buffer PF,混合均勻。

*溶液可能會出現微弱的渾濁現象,此為正常現象。

置于 56°C 孵育 8 min。室溫 4,000×g 離心 5 min

孵育后溶液將出現大量乳白色沉淀,否則延長孵育時間。

孵育后溶液有可能出現分層現象,此為正常現象。

此步驟的離心必須使用吊籃式(swing-out rotor)離心機或其他水平離心機

取無色上相至 50 ml 離心管中,加入 0.8 倍體積異丙醇(如:取得 6 ml 無色上相,則加入 4.8 ml 異丙醇),混合均勻。室溫靜置 10 min8,000×g 離心 10 min

盡可能棄盡上清。加入 2 ml 預冷的 ET-free water70% Ethanol,洗滌沉淀,8,000×g 離心 5 min

ET-free water70% Ethanol)使用前確定已加入體積的無水乙醇。

盡可能棄盡上清。在超凈臺中干燥 10-15 min

管壁上殘留液體可短暫離心后吸棄。

加入 500  Eluent A 或無內毒素水溶解質粒 DNA

 

總抗氧化能力(T-AOC) 試劑盒說明書 微量法

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