熒光定量技術服務 
 
一、項目簡介

Real Time PCR法是實時監測解析PCR擴增量的方法。因其無需電泳，大大減低了實驗污染的機率，且具有快速、可對檢測靶基因定量而倍受青睞。實時熒光定量PCR避免了傳統PCR以終產物檢測定量產生的偏差，提高實驗的重復性。該技術已被廣泛用于檢測細胞、細菌等mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結果。我們為您提供全套實時熒光定量PCR技術及解析服務：您只需提供組織或細胞標本，我們為您完成RNA抽提，cDNA制備，實時定量PCR，標準曲線制備及數據分析的所有步驟。

1、TaqMan探針方法
該技術以美國 ABI 公司為代表。 PCR 擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸片斷，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團（Reporter, R），如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團（Quencher, Q），如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號（圖4）。所以，每經過一個PCR循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。

2、SYBR Green I嵌合熒光法
SYBR Green I熒光染料技術原理：SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料（圖2）。當它與DNA雙鏈結合時，發出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。

3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。

4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。
      SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結果，對PCR引物設計的特異性和PCR反應的質量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。

二、服務項目

1、定性分析
PCR反應結束后的PCR產物無需電泳檢測，可以通過Real Time PCR方法，簡單快速地對目的基因進行高特異性、高靈敏度的檢測，同時閉管操作的實時檢測可以有效防止反應產物的污染。本技術可以廣泛應用于病毒、病原菌等致病微生物的檢測以及各種生物品種的鑒定等。

2、定量
定量首先必須構建與檢測樣品目的基因具有相同序列的標準品。使用已知濃度的標準品制作5 個點以上的標準曲線后，可以使用標準曲線對未知濃度的檢測樣品進行量（起始拷貝數）分析。

3、相對定量（mRNA表達量分析）
基因表達的研究一般采用相對定量的方法。相對定量法必須對樣品的目的基因和參比基因內標同時分別進行定量，然后求出對于參比基因的目的基因的相對量。通過對樣品間的目的基因的相對量進行比較，可以對不同樣品間的mRNA進行表達量分析。參比基因通常選用β-actin。通過同時對參比基因的實時檢測，可以對樣品之間由于起始細胞數不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進行校正，達到在嚴格意義上對樣品之間的mRNA表達量進行分析之目的。

三、服務流程

1、客戶以或郵件形式告知公司要進行的實驗基因名稱和標本數目；

2、公司派專業技術人員與您洽談實驗費用和熒光定量探針設計方案（序列和設計有公司負責）；

3、簽訂實驗技術服務合同，交費用的50%作為訂金（若實驗沒有結果或結果未達到客戶要求，訂金不退）；

4、公司合成熒光定量探針、派相關人員取回實驗標本；

5、進行RNA抽提、鑒定、cDNA合成實驗；

6、進行實時熒光定量PCR實驗（每個標本的每個基因均進行3倍平行孔實驗，保證獲得準確、*、客觀的樣品基因擴增數據）；

7、通過統計分析軟件計算目的基因的mRNA表達數據；

8、提供完整的實驗報告（實時熒光擴增曲線圖、分析數據、實驗步驟、試劑儀器）；

9、客戶交齊全額費用。

四、服務要求

1、請認真填寫Real Time PCR檢側技術服務委托單；

2、請您提供新鮮的且盡量多的材料（各種材料的 RNA 提取量請參照“總 RNA 的提取”），或直接提供純化好的總RNA（大于5μg/樣品）；（各種材料的 DNA 提取量請參照“ D NA 的提取”），或直接提供純化好的DNA（大于5μg/樣品） ；

3、如果提供的材料為細胞或組織，應保證材料新鮮：
細胞樣品：細胞培養至少達105以上，培養后細胞請勿做任何處理。
組織樣品：離體后30分鐘內入液氮保存，動物組織為5mg以上。
血液樣品：分離白細胞后，-70℃保存。

4、請通過 提供已知的全長基因序列；

5、請提供盡可能詳細的背景資料： DNA/ RNA 來源、豐度等。

五、  配套服務項目：
 
1、引物（探針）設計和篩選：
根據您提供的基因序列，我們為您提供引物（探針）的設計和篩選服務。

2、基因組DNA提取組織：
新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復凍融提供樣品量500mg以上，剩下歸還（無致病性，除脂肪組織、粘液狀組織以外）。
細胞：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復凍融提供樣品量105以上。
植物： 提供樣品量500mg以上（新鮮葉片，或4℃保存一周內的葉片），剩下歸還（新鮮組織，植物干粉得率較低）。
原核生物：提供樣品量108CFU或者0.5個麥氏單位以上（非致病性，提供菌株和培養基信息；致病性，提供滅活菌液等）。

3、基因組RNA提取
組織：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復凍融提供樣品量500mg以上，剩下歸還（無致病性，除脂肪組織、粘液狀組織以外）。
細胞：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復凍融提供樣品量105以上。
植物：提供樣品量500mg以上（要新鮮葉片，或4℃保存一周內的葉片），剩下歸還。
原核生物：提供樣品量108CFU或者0.5個麥氏單位以上。

4、質粒構建：
試驗包括：PCR產物回收、連接轉化、克隆鑒定和質粒提取。

5、RT-PCR反應
請您按要求提供試驗樣本（詳見基因組DNA提取、基因組RNA提取和反轉錄樣品要求）；或提供純化好的DNA樣品5μg。

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