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高內(nèi)涵—3D微組織球三維體積與分區(qū)分析

來源:珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司   2019年10月18日 15:59  

三維多細(xì)胞類球體(腫瘤球、微球、類器官)可以幫助我們在臨床前藥物篩選階段更好地預(yù)測多種候選藥物的潛在作用。但是,相較于二維單層培養(yǎng)細(xì)胞,采用三維培養(yǎng)細(xì)胞模型系統(tǒng)進(jìn)行檢測分析則更具挑戰(zhàn)性。

一起來看看珀金埃爾默是如何分析3D微組織球三維體積與分區(qū)的吧!

3D微組織球的制備和成像過程

使用 CellCarrier Spheroid ULA 96 孔微孔板制備細(xì)胞球

CellCarrier Spheroid表面極低吸附力96孔微孔板(珀金埃爾默公司,貨號6055330)中接種 HeLa 細(xì)胞,細(xì)胞濃度分別為1.25E3、2.5E3與5E3。48小時后,以3.7%甲醇固定,再用DRAQ5™染料對胞核染色。如前文所述,用磷酸化組蛋白H3抗體(西格瑪奧德里奇公司,貨號H9908)和Alexa 546二抗體(美國生命技術(shù)公司,貨號A11081)聯(lián)合標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞。為達(dá)到快速成像的需求,本實驗應(yīng)用長工作距離物鏡,使用表面低吸附力的U形96孔板直接成像。對于高分辨率深度成像試驗,本實驗將細(xì)胞球轉(zhuǎn)入兼容高質(zhì)量成像CellCarrier 384孔超微孔板(珀金埃爾默公司,貨號6057300),然后利用ScaleA2試劑進(jìn)行透明化處理。

“預(yù)掃描(PreciScan)”功能大大縮短圖像采集時間并減小數(shù)據(jù)量

研究人員利用Harmony軟件的“預(yù)掃描(PreciScan)”功能掃描拍攝所有細(xì)胞球的圖像。“預(yù)掃描(PreciScan)”是一項智能圖像采集功能,它可以智能識別確定各孔內(nèi)目標(biāo)細(xì)胞的x/y坐標(biāo)位置。通過低倍預(yù)掃描、智能聯(lián)機(jī)分析和高倍再掃描,生成目標(biāo)細(xì)胞的高分辨率圖像。再掃描可以包含z-stack多層掃描和 / 或時間序列掃描。“預(yù)掃描(PreciScan)”功能有效節(jié)省了測量和分析時間并減小了數(shù)據(jù)儲存空間(例如,使用20x物鏡對在384孔微孔板內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞球進(jìn)行觀察分析時,預(yù)掃描可幫助減少25倍的分析時間和數(shù)據(jù)儲存空間;而使用40x物鏡觀察時,可減少100倍的分析時間和數(shù)據(jù)儲存空間),Operetta CLS與Opera Phenix系統(tǒng)都配置有這一功能。

利用水浸物鏡與光透明化技術(shù)優(yōu)化成像深度

使用水浸物鏡,大大提高了成像質(zhì)量,特別是提升了Z軸分辨率。此外,光透明化處理進(jìn)一步改善了成像深度。光透明化處理不僅提高了樣品內(nèi)指標(biāo)的均一性,而且減少了光散射和光學(xué)像差。在此基礎(chǔ)上,采用長波長染色(如可行)也有利于減少光散射并提高透光率,使更多的激光照射在3D樣品上。因此,可顯著提升成像深度和信號檢測效率。

3D微組織球重構(gòu)與分析

生成三維或 XYZ 軸圖像

生成三維樣品的 XYZ 軸或三維圖像;

在三維空間中變換樣品圖像——旋轉(zhuǎn)、縮放或平移;

導(dǎo)出視頻——三維重建或涵蓋多層平面視圖的視頻。

 

定位細(xì)胞球與胞核

使用“定位圖像區(qū)域(Find Image Region)”功能定位整個細(xì)胞球;

采用局部光強(qiáng)閾值進(jìn)行 Z 軸光衰減補(bǔ)償;

選用一種“定位胞核(Find Nuclei)”方法——專門用于 3D 圖像胞核分割。

 

計算細(xì)胞球與胞核三維指標(biāo)

使用“計算形態(tài)特性參數(shù)(Calculate Morphology Properties)”工具分析細(xì)胞球和球體內(nèi)單細(xì)胞的三維形態(tài)特征。

胞球體積

[μm³]

球度

[-]

覆蓋面積

[μm³]

細(xì)胞球高度

[μm]

15590200

0.77

80314

286

 

定位有絲分裂細(xì)胞

使用“定位胞核(Find Nuclei)”功能,根據(jù)局部光強(qiáng)閾值定位有絲分裂、 pHH3 陽性細(xì)胞;

使用“裁剪區(qū)(Clip Box)”功能生成剖視圖,從內(nèi)部(右側(cè))觀察細(xì)胞球。

 

使用“裁剪區(qū)(Clip Box)”工具生成剖視圖

進(jìn)行細(xì)胞分區(qū),分析有絲分裂細(xì)胞分布情況

計算出每個胞核到細(xì)胞球邊界的短距離;

使用“選擇區(qū)域”和“選擇細(xì)胞群”功能,將胞核分成不同區(qū)域??呻S意調(diào)整區(qū)域?qū)挾龋?/span>

分析每個區(qū)域有絲分裂細(xì)胞數(shù)量和空間分布差異,得到各種不同的分析數(shù)據(jù)(例如,細(xì)胞形態(tài)參數(shù))。

 

使用“裁剪區(qū)(Clip Box)”工具生成剖視圖

基于Harmony4.8軟件的整體成像細(xì)胞球三維分析方法我們可以檢測到細(xì)胞球整體的形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞球同心區(qū)單細(xì)胞特性。采用DRAQ5™染料(紅色)和pHH3抗體(橙色)標(biāo)記細(xì)胞球,然后用ScaleA2試劑進(jìn)行光透明化處理5天。使用Opera Phenix或Operetta CLS系統(tǒng)裝配的20x水浸物鏡(數(shù)值孔徑1.0)和間距為1µm的 z-stack模塊(z軸掃描高度:300µm)記錄共聚焦三維圖像。Opera Phenix系統(tǒng)的3D成像質(zhì)量更佳。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn),Operetta CLS系統(tǒng)在被測HeLa細(xì)胞球的成像深度和胞核檢測性能方面與之不相上下。此處第4和第5步驟操作僅以O(shè)pera Phenix系統(tǒng)成像展示,Operetta CLS系統(tǒng)成像效果與之相當(dāng)。

參考文獻(xiàn)

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3. Smyrek, I., Stelzer, EH. (2017) Quantitative three-dimensional evaluation of immunofluorescence staining for large whole mount spheroids with light sheet microscopy. Biomed Opt Express, 8(2): 484-499. doi: 10.1364/ BOE.8.000484

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