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線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書(可見分光光度法)

來源:上海研謹生物科技有限公司   2019年10月14日 12:04  

貨號:YJ2319                                                   規格:25管/12樣

線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中,由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產生的質子電化學梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。

測定原理

復合體Ⅴ水解ATP產生ADP和Pi,通過測定Pi增加速率來測定復合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸

餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:25mL×1瓶,-20℃保存;

試劑二:25mL×1瓶,-20℃保存;

試劑三:1 mL×1瓶,-20℃保存;

試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前每支加入1.3mL 蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五:6mL×1瓶,4℃保存;

試劑六:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入3mL蒸餾水,充分混勻;溶解后 4℃保存一周;

試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存。

定磷試劑的配制:按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1的比例配制,配好的定磷試劑應為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染(請根據需要,用多少配多少)。

注意:配試劑hao用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準確稱取0.1g組織或收集500萬細菌或細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g,4℃離心 5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ(此步可選做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體Ⅴ酶活性測定。

 

 

 

測定步驟

  • 酶促反應

試劑名稱(μL)

對照管

測定管

試劑四

50

50

試劑五

200

200

樣本

 

250

混勻, 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)準確水浴 30min

試劑六

100

100

樣本

250

 

混勻,4000g,25℃離心 10min,取上清液

  • 定磷

上清液

250

250

定磷試劑

1250

125

混勻,室溫靜置10min左右,在660nm處讀 A測定管和A對照管,計算ΔA=A 測定管-A對照管。

復合體Ⅴ活性計算

標準條件下測定的回歸方程為 y = 1.2487x + 0.0361;x為標準品濃度(mmol/L),y為A值。

1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

(1)按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min /mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=64×(ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

(2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每 g 組織每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V反總×106]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361)÷1.2487×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×(ΔA-0.0361)

 

V 反總:反應體系總體積,6×10-4 L;V 樣:加入樣本體積,0.25 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。

 

線粒體復合體ⅴ試劑盒說明書微量法

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