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IVIS視角 | 活體成像助力隱孢子蟲感染可視化模型構建

來源:珀金埃爾默企業管理(上海)有限公司   2019年09月09日 15:23  

隨著生活水平和醫療衛生狀況的不斷提升,寄生蟲感染在我們日常生活中似乎已日漸陌生。但在一些欠發達地區,由于貧困和不良的衛生習慣造成的寄生蟲感染仍然威脅著無數生命。隱孢子蟲作為一種常見的人畜共患寄生蟲感染性疾病,是導致腹瀉病的主要原因。由于其經由糞便傳播,所以常經由水體污染而在衛生條件較差的地區發生群體性感染。感染通常是自限性的,健康的成年人在發生階段的較嚴重的腹瀉之后便可恢復,但糞便仍可能具有傳染性。新生兒或免疫力低下的如艾滋病患者或經免疫抑制治療的病人在感染后病情較嚴重,是兒童早期死亡、營養不良和生長遲緩的重要原因,也是艾滋病人并發腹瀉死亡的主要原因。

現今發現的隱孢子蟲共有15個亞種,分別感染人、家禽、寵物、牲畜以及一些野生動物。由于不了解其致病機制,目前的治療方案往往是對癥用藥而非對因用藥。由于不同物種間感染模式差異,在實驗動物(主要為牛等家畜)上應對隱孢子蟲感染的有效疫苗往往對預防人的感染收效甚微。

針對以上問題,來自美國賓大獸醫學院的研究人員發現了一種可用在小鼠模型中模擬與人患隱孢子蟲病相似病癥的隱孢子蟲(Cryptosporidium tyzzeri), 同時利用IVIS小動物活體成像系統幫助他們在體研究隱孢子蟲的感染以及宿主經寄生蟲或疫苗免疫激活后的抗感染現象。該研究于近期發表在Cell子刊Cell Host & Microbe上。

要在小鼠體內模擬人患隱孢子蟲病的合理模型,首先就需要找到相應的隱孢子蟲。作者在農場收集了大量小家鼠糞便,經由測序,鑒定出一株與感染人的兩種隱孢子蟲(C. parvumC. hominis)接近的一種鼠隱孢子蟲(C. tyzzeri)。同時為了后續在體觀察其感染模式以及宿主抗感染效果,作者通過CRISPR-Cas9技術將Luciferase基因和mCherry熒光蛋白導入到隱孢子蟲的基因組中,構建了一株可以進行活體以及顯微觀察的隱孢子蟲。

 

圖一C. tyzzeri的鑒定以及基因編輯 (上:隱孢子蟲種間基因組相似性比較,AB為常見感染人的兩種隱孢子蟲,C為常見感染鼠的隱孢子蟲)

構建好的隱孢子蟲就可以進行活體觀察了,由于有活力的隱孢子蟲可以表達Luciferase,在底物熒光素的作用下便可自發熒光,通過IVIS活體成像系統來實時監測體內隱孢子蟲的繁殖情況。作者將這一光學觀察方式與傳統的糞便qPCR檢測結果進行驗證,二者具有很好的一致性。作者除了觀察到這一新鑒定的隱孢子蟲感染和人患隱孢子蟲病的感染部位以及病理表征一致之外,還觀察到了具有免疫缺陷的鼠(IFN-γ、Rag基因的敲除鼠 )也更易受到隱孢子蟲的危害,這一點與臨床上免疫缺陷病人的高發病致死率也剛好吻合。

 

圖二  C. tyzzeri感染模式觀察

有了這一能夠很好模擬人隱孢子蟲感染的實驗動物模型之后,便可以利用這一模型進行隱孢子蟲的治療以及疫苗的開發。由于臨床上隱孢子蟲高發地區人們在感染*后再度感染的概率大大降低,因此作者首先檢驗了蟲體是否可以直接作為疫苗來進行感染的預防。利用未經Luciferase標記的C. tyzzeri進行次感染,同時實驗組使用滅活的蟲體作為疫苗進行次免疫,在感染后用廣譜抗蟲藥巴龍霉素殺滅后用Luc標記C. tyzzeri進行二次感染,能夠觀察到接觸活蟲的小鼠幾乎不會發生二次感染,而使用滅活蟲體作為疫苗無法激活體內免疫系統進行后續的抗感染作用。

 

圖三 使用滅活的C. tyzzeri無法預防感染

因此作者想到可以使用減毒的活蟲對宿主進行次免疫。通過射線進行寄生蟲減毒處理,可以降低其感染力至無害水平。在減毒活蟲感染后30天,在使用Luc標記的C. tyzzeri進行感染,能夠觀察到該方法與野生型活蟲二次感染模型有著相同的抗感染作用,說明減毒的疫苗是一種行之有效的預防隱孢子蟲感染的方式。但是由于要調動自身免疫系統,這一方法在免疫缺陷的小鼠身上仍不奏效。

 

圖四 使用減毒疫苗可以有效對隱孢子蟲進行預防

雖然這篇文章也并未真正解決隱孢子蟲的抗感染問題,但是構建出針對這一寄生蟲病的實驗小鼠模型已經為后續的科研工作者嘗試更多治療方案和預防措施提供了可操作可監控的實驗工具。

參考文獻

1. A Genetically Tractable, Natural Mouse Model of Cryptosporidiosis Offers Insights into Host Protective Immunity. Adam Sateriale et al., 2019, Cell Host & Microbe 26, 1–12

https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.00

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