菲羅門技術部電話日常：

—  我（ 董麗華）：您好，菲羅門技術部，請問有什么可以幫助您？

—  客戶：新柱子，測出來的柱效咋這么低？柱子是不是有問題？腫么回事？

    我內心：“聽，那是心碎的聲音。死亡三聯問，擊碎了我弱小脆弱的心。突然想到，與其每次授人以魚，不如借此平臺授人以漁。”

言歸正傳嘍

首先，常識是：新色譜柱拿到手里，一定要進行色譜柱效能測試。這樣，先判斷這根色譜柱是否是合格品，很關鍵的一點是，及時測試柱效后發現問題。

一經核實，可向廠家提出退換貨。一旦色譜柱正常使用，后續再出現問題，用戶很難向廠家申請到退換貨的。所以，做新柱子的性能測試，可以保證您的利益。

我們先來了解下色譜柱效能評價（以下以反相色譜柱作為例子）

一、反相色譜柱評價條件

對于一根填充柱來說，基本的柱性能評價指標是柱效和峰對稱的測定。反相色譜柱評價所需常用的流動相一般是甲醇或者乙腈與水的體系，對于含有酸堿性組份的樣品，流動相為甲醇或者乙腈與緩沖鹽的體系；檢測波長一般在254nm下檢測，因為在此波長處，甲醇、乙腈，磷酸緩沖鹽均沒有紫外吸收，而且標準樣品多為含苯環的物質，在254nm波長紫外吸收強，選擇此波長檢測可以避免流動相戲外吸收的干擾；柱溫一般在室溫下測定，均不超過30℃；對于通常的標準柱型，即Φ4.6mm×250mm的柱子來說，流速以1ml/min為宜。

柱壓則為實測值，它不僅與色譜柱有關，而且取決于流動相，以及評價色譜柱的溫度與流速。

二、反相色譜柱評價的標準物質

通常,以的一組標準溶質為樣品,測定它們在柱子上的理論塔板數，以作為柱效的衡量指標。這種標準溶質的選擇，因不同的色譜模式而異，也因不同的使用目的而有所不同。一般情況下，僅選用3-4中中性，例如芳香烴，多選用5種。要求它們具有不同的保留因子（例如，個化合物k=0，其余的在2～10范圍內），能反映出對柱子性質的基本要求，而且能在一般的HPLC裝置上得到清晰的信號。反相色譜柱評價所用的標準樣品各不相同，

采用NaNO₃,NH₂NO₃，尿嘧啶，硫脲等作為樣品，進行死時間的測定，一般可得較近的結果。雖然很多資料證實尿嘧啶有保留，但因其峰型相對較好等原因一直得到廣泛得應用。

衡量柱效的物質則千差萬別，由苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等，一般以后洗脫出的組分衡量柱效（可以弱化死體積的影響外，同時與色譜柱填料充分接觸）。

衡量色譜柱分離堿性樣品的柱效，不對稱度，可用阿米替林。

三、可能的影響柱效的因素（除色譜柱本身）

    這里我們先不談峰的對稱性，當峰不對稱的時候，柱效一定低的，我們暫時只考慮柱效低的影響因素有哪些。

柱外效應是指色譜柱之外的造成色譜峰展寬的成因，從進樣系統到檢測器之間色譜柱以外流路部分，主要由進樣裝置、檢測池及它們與柱之間的連接管路所產生，并對柱效能產生的影響。

進樣裝置的影響：例如手動進樣，樣品注射的速度影響樣品的擴散范圍大小，使峰展寬，影響柱效。

檢測池的影響：檢測池體積大，使樣品被流動相稀釋，不僅會降低檢測靈敏度，還使峰展寬。除了池體積大小的影響外，池的結構特點（幾何形狀）和池內的流動特性（從連接管到樣品池由于直徑變化引起的）都會影響峰展寬。假如樣本同時達到檢測池，通過縱向和橫向擴散，在檢測池中擴散的范圍值為檢測室的體積。所以池體積小，峰展寬會小。目前使用的檢測池體積大多數都小于等于8μL，對于常規分析一般沒有多大影響。另外，當使用小體積柱時，故希望檢測池體積小于5μL，微量色譜柱的體積應減少到1μL，甚至更小。

連接管對色譜峰擴展的影響，是由于流動相在空管中的流動速度分布的縱斷面呈拋物線狀，管中心的樣品分子比管壁部分的樣品分子先到達樣品池，因此引起了峰擴展。檢測池與色譜柱出口的連接，或者幾個檢測器之間的連接，應采用細內徑連接管并控制短的距離，以使峰擴展小。但應注意，連接管內徑減小時，管內壓力降會有所增加。一般*使用內徑0.1mm(或0.2mm)的不銹鋼或PEEK管,長度應盡可能地短。

題外話：有時候做方法時，理論上兩個物質的分離度大于1.5，但實際*達2.0，因為不同儀器的樣品池和連接管對峰擴展的貢獻有可能使在色譜柱上已經分離了的組分在樣品池中又重疊混合，轉移后的方法重現不出。

檢測器的參數影響。檢測器的時間常數包括檢測器傳感器和電子元件的響應時間，它間接對色譜系統的小檢測量和低檢測濃度產生影響。一般說來，傳感器的響應較快。而檢測器放大器和記錄儀的時間常數有可能過大，使色譜峰變形失真，導致柱效下降，也影響色譜分析的可靠性和準確性。目前使用的檢測器和記錄儀的時間常數一般在0.5s-1.0s 就是合適的。

標準物質的濃度與進樣體積的影響。用兩個（正常至超載連續圖）的例子，用柱效的數學來解釋原理。N=16(t_R/W)².其中t_R是保留時間；W為峰寬。

左圖：樣品質量對峰寬和峰型的影響,峰1到峰4，進樣質量逐漸增大。

右圖：樣品體積對峰寬和峰型的影響,峰1到峰4，進樣體積逐漸增大。

上面的圖顯示，隨著樣品質量和體積的增大，W增大的程度遠大于t_R增量，所以t_R/W總比值是變小的，此比值與柱效呈正相關，所以柱效會下降。

四、總結

通過上述的講解，大家有沒有明白柱效為什么會降低呢？有沒有體會到擁有“漁技”的快樂？有沒有內心從容一些？

色譜柱在出廠的過程中有專門優化過的機器來進行色譜柱測試性能，各方面條件和現實中是有差異。所以新購來的柱子在實驗室中所測得的柱效，往往低于生產廠家給出的柱效。

色譜柱測試時，可以根據廠家隨柱附帶的測試報告來測試。當然，各實驗室可根據自己的要求配制自己的標準溶質。

我們技術部建議：次柱測試，*和廠家提供的標準圖相比較，選用與廠家相同的測試條件，有可靠的參考標準。

1. 常規HPLC色譜柱，數值超過柱報告柱效上70%，則屬于合格品。

2. 標準物質的濃度與進樣體積，請向廠家詢問清楚。

3. 測試物質選取的不同，作用也是不同的。對于柱效這個參數，一般測定混合物的較靠后面的峰的數值作為比較標準。

4. 在HPLC儀器上測試內徑小于3mm的色譜柱時，柱效這個數據已經不準確，這個時候要關注出峰時間是否與柱報告上的物質相近（管路長短、寬窄引起時間微小差異），峰是否變形。*UHPLC儀器來測定UHPLC的小粒徑小體積柱。