細胞鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  細胞鈣離子濃度比色法定量檢測試劑是一種旨在通過鄰甲酚酞絡合酮，在堿性條件下與鈣離子反應產生紫藍色復合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中總鈣離子濃度的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞（動物、人體等）裂解萃取樣品中總鈣離子的濃度檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測敏感。

技術背景

鈣是人體中的一種重要電介質和礦物質，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結合鈣，其構成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經傳導介質、信使傳導等方面起著重要作用。鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。鄰甲酚酞絡合酮（o-cresolphthalein complexone；CPC）比色法是一種穩定、簡便、準確的鈣檢測技術。鈣與鄰甲酚酞絡合酮，在堿性條件下反應產生紫藍色復合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化（波長570nm），來定量測定細胞鈣的總濃度。其反應系統為：

OH^-

  Ca^＋＋  +  o-cresolphthalein complexone   →    violet complex dye

產品內容

  清理液（Reagent A）     120毫升

  裂解液（Reagent B）  5毫升

  緩沖液（Reagent C） 20毫升

  反應液（Reagent D）     2.5毫升

  標準液（Reagent E）    500微升

產品說明書     1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；  緩沖液（Reagent C）、  反應液（Reagent D）和  標準液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于標準樣品配制和樣品保存的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品制備

比色皿：用于反應的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟 

• 樣品準備
  • 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1 X 10⁶細胞）
  • 小心加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
  • 加入3毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞
  • 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
  • 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入200微升  裂解液（Reagent B），充分混勻
  • 轉移到預冷的1.5毫升離心管
  • 強力渦旋震蕩15秒
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
  • 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
  • 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
  • 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
    • 測定準備
• 準備好上述制備的待測樣品，置于冰槽里備用
• 設定好分光光度儀：波長570nm，并置零 
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入100微升  緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取200微升  標準液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取100微升1號管的  標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取100微升2號管稀釋的  標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取100微升3號管稀釋的  標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

三、比色測定

• 移取800微升  緩沖液（Reagent C）到新的1毫升比色皿
• 加入100微升  反應液（Reagent D）
• （選擇步驟）放進分光光度儀，置零
• （選擇步驟）取出比色皿
• 加入100微升上述配制的標準液或待測樣品 
• 上下傾倒數次，混勻
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數（OD）
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（OD）；橫座標（X軸）為標準鈣濃度（毫摩爾/升）
• 根據標準曲線獲得樣品對應鈣濃度（毫摩爾/升）
• 計算樣品實際鈣濃度（毫摩爾/升）

【根據標準曲線獲得樣品對應鈣濃度（毫摩爾/升） X 樣品稀釋倍數】＝毫摩爾/升

注意事項

• 本產品為25次操作，包括標準液
• 操作時，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 建議樣品保存在－70℃冰箱里
• 系統操作過程中，標準液測定只需1次
• 孵育反應完成后即刻進行比色測定
• 如果樣本鈣離子過低，可以增加孵育時間至30分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 如果用戶沒有匹配的濾波器，可以使用570nm至600nm之間的任一波長
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 檢測范圍在5微摩爾/升至0.5毫摩爾/升鈣濃度范圍：參考標準曲線如下

• 如果用戶需要檢測1至4毫摩爾/升鈣濃度，請購買相應的標準液即可
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感