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小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA分析試劑盒

來源:銘修(上海)生物科技有限公司   2019年08月14日 15:08  

 小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA分析試劑盒產品說明書

(中文版)

 

主要用途

 

 小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA分析試劑是一種旨在使用單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗體競爭性結合樣品中的8-羥基脫氧鳥苷,進而使用辣根過氧化酶綴合二抗,由生色染料四甲基聯苯胺參與反應,呈現黃色產物,即通過酶聯免疫吸附反應(ELISA)比色法定量評價DNA損傷水平的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種小鼠細胞和組織裂解產物,以及體液樣品8-羥基脫氧鳥苷的定量分析。廣泛用于細胞衰老、細胞凋亡、腫瘤等的研究。產品即到即用,反應敏感,操作簡捷,性能穩定,顯色清晰。

 

技術背景

 

核酸氧化損傷(nucleotide oxidative damage),包括DNA和RNA損傷,是由于環境因子或細胞代謝影響,在逃避細胞防御機制的前提下,所產生的四種損傷之一:氧化、烷化(alkylation)、水解和堿基錯配損傷等。而氧化損傷主要通過活性氧族(reactive oxygen species;ROS),包括超氧自由基陰離子superoxide radicalO2-)、過氧化氫(hydrogen peroxide;H2O2)、羥自由基或氫氧基(hydroxyl radical;OH-)、過氧peroxyl radical;ROO-)、氫過氧自由基hydroperoxylHOO)、烷氧自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric OxideNO-過氧亞硝基陰離子peroxynitrite anionONOO-)等的作用,使堿基羥基化和嘌呤環裂開,誘導鳥嘌呤(guanine;G)向胸腺嘧啶(thymine;T)的顛換(transversion),造成體細胞基因突變,影響細胞周期、基因轉錄、細胞凋亡等,終導致各種疾病的發生,例如糖尿病、高血壓、中風、癌癥、衰老等。其中核酸損傷產物8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine;8-OHdG)作為DNA損傷的分子標志;8-羥基鳥苷(8-hydroxyguanosine)作為RNA損傷的分子標志。8-羥基脫氧鳥苷是常見的DNA損傷產物,也是氧化應急的生物標志。通過使用酶聯免疫吸附反應(enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA),即基于單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗體競爭性結合樣品中的8-羥基脫氧鳥苷,進而使用辣根過氧化酶綴合二抗,由生色染料四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)參與反應,呈現黃色產物,在分光光度儀下(450nm波長),定量檢測8-羥基脫氧鳥苷的含量。

 

產品內容

 

 標記液(Reagent A)         

 酶促液(Reagent B)    毫升

 清理液(Reagent C)    毫升

 底物A(Reagent D)    毫升

 底物B(Reagent E)    毫

 終止液(Reagent F)    

 標準液(Reagent G)    毫升

 抗體酶標板 96孔

產品說明書 1份

 

 

保存方式

 

保存在4冰箱里;暫時不用,保存在-20箱里; 底物B(Reagent E)易揮發,密閉瓶蓋,避免光照; 抗體酶標板,密封干燥保存;有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于工作液配制

培養箱:用于反應孵育

酶標儀:用于比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前,將-20℃或4冰箱里試劑盒中的試劑置于室溫下30分鐘均衡溫度。然后進行下列操作:

  • 標準樣品管濃度表:

 標準液(Reagent G

 標準8-羥基鳥苷濃度

G1

xx克/毫升

G2

xx克/毫升

G3

xx克/毫升

G4

xx克/毫升

G5

xx克/毫升

G6

0

 

  • 標準樣品和待測樣品測定
  • 準備1個 抗體酶標板:標記好空白對照、標準樣品、待測樣品
  • 加入50微升用戶自備的無離子水到空白對照孔里
  • 分別加入xx微升 標準液G1至G6到對應的標準樣品孔里
  • 加入50微升待測樣品到待測樣品孔里
  • 加入xx微升 標記液(Reagent A)到待測樣品孔里
  • 分別加入xx微升 酶促液(Reagent B)到標準樣品和待測樣品孔里
  • 搖動酶標板,充分混勻
  • 密封酶標板
  • 進37培養箱里孵育60分鐘(注意:培養箱保持濕潤,避免干化)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升 清理液(Reagent C)
  • 室溫下孵育10秒
  • 小心抽去清理液(注意:確保沒有液體殘留)
  • 重復實驗步驟11至13四次
  • 準備1個1.5毫升離心管
  • 分別加入等量的 底物液A(Reagent D) 底物液B(Reagent E),混勻
  • 加入xx微升上述配制的 底物工作液到標準樣品和待測樣品孔里
  • 室溫下孵育15分鐘,避免光照(注意:可見藍色沉淀
  • 加入xx微升 終止液(Reagent F),混勻(注意:可見藍色變成黃色
  • 即刻放進酶標儀測讀:450nm波長(注意:不宜超過30分鐘)
  • 構建8羥基脫氧鳥苷標準曲線:縱座標(Y軸)為吸光值(OD);橫坐標(X軸)為8-羥基脫氧鳥苷濃度(納克/毫升)
  • 根據標準曲線獲得樣品對應8-羥基脫氧鳥苷濃度納摩爾/毫升)

 

注意事項

 

  • 本產品為96次操作量
  • 本產品檢測敏感度達0.01納克/毫升
  • 操作時,須戴手套
  •  抗體酶標板可以拆卸,用戶根據實際需求,選擇需要的孔板
  • 系統操作時,標準樣品測定只需一次
  • 孵育時,須避免光照
  • 加樣時確保加入孔底,避免濺出和氣泡
  • 注意加樣時,避免交叉污染,避免污染母液
  • 建議使用濕度充分的培養箱
  • 用戶根據實際用量,配制 底物工作液;須新鮮配制,即刻使用
  • 建議染色完成后,即刻進行比色分析
  • 本公司提供系列核酸損傷檢測試劑產品

 

質量標準

 

  • 本產品經鑒定性能穩定
  • 本產品經鑒定檢測敏感

 

 

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