小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA分析試劑盒產品說明書
(中文版)
主要用途
小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA分析試劑是一種旨在使用單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗體競爭性結合樣品中的8-羥基脫氧鳥苷,進而使用辣根過氧化酶綴合二抗,由生色染料四甲基聯苯胺參與反應,呈現黃色產物,即通過酶聯免疫吸附反應(ELISA)比色法定量評價DNA損傷水平的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種小鼠細胞和組織裂解產物,以及體液樣品8-羥基脫氧鳥苷的定量分析。廣泛用于細胞衰老、細胞凋亡、腫瘤等的研究。產品即到即用,反應敏感,操作簡捷,性能穩定,顯色清晰。
技術背景
核酸氧化損傷(nucleotide oxidative damage),包括DNA和RNA損傷,是由于環境因子或細胞代謝影響,在逃避細胞防御機制的前提下,所產生的四種損傷之一:氧化、烷化(alkylation)、水解和堿基錯配損傷等。而氧化損傷主要通過活性氧族(reactive oxygen species;ROS),包括超氧自由基陰離子(superoxide radical;O2-)、過氧化氫(hydrogen peroxide;H2O2)、羥自由基或氫氧基(hydroxyl radical;OH-)、過氧化基(peroxyl radical;ROO-)、氫過氧自由基(hydroperoxyl;HOO)、烷氧自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric Oxide;NO-)、過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion;ONOO-)等的作用,使堿基羥基化和嘌呤環裂開,誘導鳥嘌呤(guanine;G)向胸腺嘧啶(thymine;T)的顛換(transversion),造成體細胞基因突變,影響細胞周期、基因轉錄、細胞凋亡等,終導致各種疾病的發生,例如糖尿病、高血壓、中風、癌癥、衰老等。其中核酸損傷產物8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine;8-OHdG)作為DNA損傷的分子標志;8-羥基鳥苷(8-hydroxyguanosine)作為RNA損傷的分子標志。8-羥基脫氧鳥苷是常見的DNA損傷產物,也是氧化應急的生物標志。通過使用酶聯免疫吸附反應(enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA),即基于單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗體競爭性結合樣品中的8-羥基脫氧鳥苷,進而使用辣根過氧化酶綴合二抗,由生色染料四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)參與反應,呈現黃色產物,在分光光度儀下(450nm波長),定量檢測8-羥基脫氧鳥苷的含量。
產品內容
標記液(Reagent A) 毫升
酶促液(Reagent B) 毫升
清理液(Reagent C) 毫升
底物液A(Reagent D) 毫升
底物液B(Reagent E) 毫升
終止液(Reagent F) 毫升
標準液(Reagent G) 毫升
抗體酶標板 96孔
產品說明書 1份
保存方式
保存在4℃冰箱里;暫時不用,保存在-20℃冰箱里; 底物液B(Reagent E)易揮發,密閉瓶蓋,避免光照; 抗體酶標板,密封干燥保存;有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管:用于工作液配制
培養箱:用于反應孵育
酶標儀:用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前,將-20℃或4℃冰箱里試劑盒中的試劑置于室溫下30分鐘均衡溫度。然后進行下列操作:
- 標準樣品管濃度表:
標準液(Reagent G) | 標準8-羥基鳥苷濃度 |
G1 | xx納克/毫升 |
G2 | xx納克/毫升 |
G3 | xx納克/毫升 |
G4 | xx納克/毫升 |
G5 | xx納克/毫升 |
G6 | 0 |
- 標準樣品和待測樣品測定
- 準備1個 抗體酶標板:標記好空白對照、標準樣品、待測樣品
- 加入50微升用戶自備的無離子水到空白對照孔里
- 分別加入xx微升 標準液G1至G6到對應的標準樣品孔里
- 加入50微升待測樣品到待測樣品孔里
- 加入xx微升 標記液(Reagent A)到待測樣品孔里
- 分別加入xx微升 酶促液(Reagent B)到標準樣品和待測樣品孔里
- 搖動酶標板,充分混勻
- 密封酶標板
- 放進37℃培養箱里孵育60分鐘(注意:培養箱保持濕潤,避免干化)
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升 清理液(Reagent C)
- 室溫下孵育10秒
- 小心抽去清理液(注意:確保沒有液體殘留)
- 重復實驗步驟11至13四次
- 準備1個1.5毫升離心管
- 分別加入等量的 底物液A(Reagent D)和 底物液B(Reagent E),混勻
- 加入xx微升上述配制的 底物工作液到標準樣品和待測樣品孔里
- 室溫下孵育15分鐘,避免光照(注意:可見藍色沉淀)
- 加入xx微升 終止液(Reagent F),混勻(注意:可見藍色變成黃色)
- 即刻放進酶標儀測讀:450nm波長(注意:不宜超過30分鐘)
- 構建8羥基脫氧鳥苷標準曲線:縱座標(Y軸)為吸光值(OD);橫坐標(X軸)為8-羥基脫氧鳥苷濃度(納克/毫升)
- 根據標準曲線獲得樣品對應8-羥基脫氧鳥苷濃度(納摩爾/毫升)
注意事項
- 本產品為96次操作量
- 本產品檢測敏感度達0.01納克/毫升
- 操作時,須戴手套
- 抗體酶標板可以拆卸,用戶根據實際需求,選擇需要的孔板
- 系統操作時,標準樣品測定只需一次
- 孵育時,須避免光照
- 加樣時確保加入孔底,避免濺出和氣泡
- 注意加樣時,避免交叉污染,避免污染母液
- 建議使用濕度充分的培養箱
- 用戶根據實際用量,配制 底物工作液;須新鮮配制,即刻使用
- 建議染色完成后,即刻進行比色分析
- 本公司提供系列核酸損傷檢測試劑產品
質量標準
- 本產品經鑒定性能穩定
- 本產品經鑒定檢測敏感
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