小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA分析試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

 小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA分析試劑是一種旨在使用單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗體競爭性結合樣品中的8-羥基脫氧鳥苷，進而使用辣根過氧化酶綴合二抗，由生色染料四甲基聯苯胺參與反應，呈現黃色產物，即通過酶聯免疫吸附反應（ELISA）比色法定量評價DNA損傷水平的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種小鼠細胞和組織裂解產物，以及體液樣品8-羥基脫氧鳥苷的定量分析。廣泛用于細胞衰老、細胞凋亡、腫瘤等的研究。產品即到即用，反應敏感，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

核酸氧化損傷（nucleotide oxidative damage），包括DNA和RNA損傷，是由于環境因子或細胞代謝影響，在逃避細胞防御機制的前提下，所產生的四種損傷之一：氧化、烷化（alkylation）、水解和堿基錯配損傷等。而氧化損傷主要通過活性氧族（reactive oxygen species；ROS），包括超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）等的作用，使堿基羥基化和嘌呤環裂開，誘導鳥嘌呤（guanine；G）向胸腺嘧啶（thymine；T）的顛換（transversion），造成體細胞基因突變，影響細胞周期、基因轉錄、細胞凋亡等，終導致各種疾病的發生，例如糖尿病、高血壓、中風、癌癥、衰老等。其中核酸損傷產物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine；8-OHdG）作為DNA損傷的分子標志；8-羥基鳥苷（8-hydroxyguanosine）作為RNA損傷的分子標志。8-羥基脫氧鳥苷是常見的DNA損傷產物，也是氧化應急的生物標志。通過使用酶聯免疫吸附反應（enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA），即基于單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗體競爭性結合樣品中的8-羥基脫氧鳥苷，進而使用辣根過氧化酶綴合二抗，由生色染料四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）參與反應，呈現黃色產物，在分光光度儀下（450nm波長），定量檢測8-羥基脫氧鳥苷的含量。

產品內容

 標記液（Reagent A）         毫升

 酶促液（Reagent B）    毫升

 清理液（Reagent C）    毫升

 底物液A（Reagent D）    毫升

 底物液B（Reagent E）    毫升

 終止液（Reagent F）    毫升

 標準液（Reagent G）    毫升

 抗體酶標板 96孔

產品說明書 1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；暫時不用，保存在－20℃冰箱里； 底物液B（Reagent E）易揮發，密閉瓶蓋，避免光照； 抗體酶標板，密封干燥保存；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制

培養箱：用于反應孵育

酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃或4℃冰箱里試劑盒中的試劑置于室溫下30分鐘均衡溫度。然后進行下列操作：

• 標準樣品管濃度表：

• 標準樣品和待測樣品測定

• 準備1個 抗體酶標板：標記好空白對照、標準樣品、待測樣品
• 加入50微升用戶自備的無離子水到空白對照孔里
• 分別加入xx微升 標準液G1至G6到對應的標準樣品孔里
• 加入50微升待測樣品到待測樣品孔里
• 加入xx微升 標記液（Reagent A）到待測樣品孔里
• 分別加入xx微升 酶促液（Reagent B）到標準樣品和待測樣品孔里
• 搖動酶標板，充分混勻
• 密封酶標板
• 放進37℃培養箱里孵育60分鐘（注意：培養箱保持濕潤，避免干化）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent C）
• 室溫下孵育10秒
• 小心抽去清理液（注意：確保沒有液體殘留）
• 重復實驗步驟11至13四次
• 準備1個1.5毫升離心管
• 分別加入等量的 底物液A（Reagent D）和 底物液B（Reagent E），混勻
• 加入xx微升上述配制的 底物工作液到標準樣品和待測樣品孔里
• 室溫下孵育15分鐘，避免光照（注意：可見藍色沉淀）
• 加入xx微升 終止液（Reagent F），混勻（注意：可見藍色變成黃色）
• 即刻放進酶標儀測讀：450nm波長（注意：不宜超過30分鐘）
• 構建8羥基脫氧鳥苷標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光值（OD）；橫坐標（X軸）為8-羥基脫氧鳥苷濃度（納克/毫升）
• 根據標準曲線獲得樣品對應8-羥基脫氧鳥苷濃度（納摩爾/毫升）

注意事項

• 本產品為96次操作量
• 本產品檢測敏感度達0.01納克/毫升
• 操作時，須戴手套
•  抗體酶標板可以拆卸，用戶根據實際需求，選擇需要的孔板
• 系統操作時，標準樣品測定只需一次
• 孵育時，須避免光照
• 加樣時確保加入孔底，避免濺出和氣泡
• 注意加樣時，避免交叉污染，避免污染母液
• 建議使用濕度充分的培養箱
• 用戶根據實際用量，配制 底物工作液；須新鮮配制，即刻使用
• 建議染色完成后，即刻進行比色分析
• 本公司提供系列核酸損傷檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感