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PCR工作原理及步驟

來源:廣州譽維生物科技儀器有限公司   2011年05月16日 10:45  

技術原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在

 

聚合酶鏈式反應

實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,并設計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展。發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,并逐步應用于臨床。

工作原理

類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火(復性)--延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時

  

聚合酶鏈式反應

間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

工作步驟

標準的PCR過程分為三步:

1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA

2.退火(復性)(25℃-65℃):系統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。

3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右*的活性)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′ 端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。如圖所示:

現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是*也能在很短的時間內復制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度。

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