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立式高壓滅菌器在使用前，要先將蒸汽管道內冷凝水排放干凈，蒸汽源壓力達到0.3-0.5MPa后，打開蒸汽閥門；自帶蒸發器設備，檢查滅菌用水是否準備就緒；打開與滅菌器連接的水源開關，檢查水源壓力是否達到0.15MPa以上。打開空氣壓縮機電源，待壓力達到0.5MPa以上后，打開壓縮空氣閥門；打開設備動力電源和控制電源，待夾套壓力達到0.235MPa時再運行程序；檢查密封圈、前封板和門板有無雜物，用干凈的棉布擦拭干凈。
放入滅菌物品后，關閉密封門，開始進行滅菌。滅菌過程中，應密切觀察設備的運行狀況，如有異常，及時處理；滅菌結束后，待室內壓力達到安全壓力（標準大氣壓下：-10KPa～10KPa）時，方可打開門取出物品。
使用后應切斷設備控制電源、動力電源和空氣壓縮機電源；關閉水源開關及壓縮空氣閥門。每日工作完畢，滅菌器內外及其操作間應保持清潔，應將滅菌室污物清洗干凈；管路上的過濾器，應至少半年清理一次，以防雜質堵塞。
立式高壓滅菌器使用時應注意以下事項：
待滅菌的物品放置不宜過緊。
滅菌完畢后，不可放氣減壓，否則瓶內液體會劇烈沸騰，沖掉瓶塞而外溢甚至導致容器爆裂。須待滅菌器內壓力降至與大氣壓相等后才可開蓋。
必須將冷空氣充分排除，否則鍋內溫度達不到規定溫度，影響滅菌效果。
裝培養基的試管或瓶子的棉塞上，應包油紙或牛皮紙，以防冷凝水入內。
為了確保滅菌效果，應定期檢查滅菌效果，常用的方法是將硫磺粉末（熔點為115℃）或安息香酸（熔點為120℃）置于試管內，然后進行滅菌試驗。如上述物質熔化，則說明高壓蒸氣滅菌器內的溫度已達要求，滅菌的效果是可靠的。也可將檢測滅菌器效果的膠紙（其上有溫度敏感指示劑）貼于待滅菌的物品外包裝上，如膠紙上指示劑變色，亦說明滅菌效果是可靠的。
現在已有微電腦自控型滅菌器，只需放去冷氣后，儀器即可自動恒壓定時，時間一到則自動切斷電源并鳴笛，使用起來很方便。
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