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單克隆篩選的加藥時(shí)間和維持濃度
由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)，所以單克隆篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，終導(dǎo)致單克隆篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開(kāi)始篩選。
隨著細(xì)胞的代謝的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次篩選液，這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。加抗生素的時(shí)機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)，一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素，挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。
關(guān)于維持濃度，有人說(shuō)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個(gè)陽(yáng)性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。
單克隆篩選時(shí)的培養(yǎng)液。單克隆篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問(wèn)題：1.死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液；2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。
單克隆篩選時(shí)出現(xiàn)的問(wèn)題及其解決辦法：
做細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長(zhǎng)出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過(guò)程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開(kāi)，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞 簇離的很近），就是說(shuō)幾個(gè)細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒(méi)有辦法做下去了，該怎么辦？
a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤(rùn)洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響；
b、加入胰酶后，稍過(guò)幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時(shí)，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散；
c、顯微鏡下觀察細(xì)胞*松散開(kāi)，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀
d、具體消化的時(shí)間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞尚未*松散開(kāi)，可以再重復(fù)的，直到松散開(kāi)，能夠被吸走為止。
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