一、技術簡介

外泌體是這幾年開始興起的一個朝陽領域，它是細胞分泌的一種直徑在30-100nm（另一種說法是 30-150nm）的膜泡結構，可以介導細胞間物質的交換和信息通訊。有研究分為9個類別依次為：單囊泡、雙囊泡、多膜泡、小雙層膜泡、橢圓膜泡、小管、大管、不完整的膜泡、不規則膜泡，其中在不同類別的囊泡中可以發現三個附加特征：表面具涂層的膜泡、內含纖維的膜泡、電子致密囊泡。

相信大家對這些早已耳熟能詳，在此不多做贅述。外泌體的分離是困擾剛剛進入該領域研究者的主要問題，從分離角度講目前大家分離外泌體主要通過一下集中手段：差速超速離心法、梯度密度離心法、沉淀試劑盒、凝膠排阻分離法、膜親和試劑盒等手段，后兩者主要用于同時分離所有的胞外囊泡組分。以上諸多分離方法中，梯度密度離心的分離方法是*可以得到高純度的分離方法，但是操作相對復雜，目前使用并不廣泛。以目前的手段來說，我們很難拿到純的外泌體組分，而多是以外泌體為主要組分的胞外微囊泡，在這里對兩者不做過多區分。關于分離的一些經驗技巧，朋友們可以參考 “外泌體之家” 分離鑒定板塊的相關貼子，適時在以后的文章中會詳細展開。

外泌體的鑒定是既分離后又一個困擾研究者的問題，一般研究者需要通過透射電鏡觀測樣本中是否存在外泌體樣結構（通常為茶托型或一側凹陷的半球形），通過粒子直徑分析系統測算和統計樣品中粒子的直徑分布，通過western blot檢測樣品中是否有外泌體相關marker蛋白的富集。另外，當電鏡圖觀測到的樣品結構不是典型外泌體樣結構時，還需要增加免疫膠體金電鏡進行驗證。本文將通過納米顆粒與外泌體電鏡圖像的對比來總結外泌體電鏡圖的鑒別方法，爭取讓大家明白為什么外泌體電鏡需要看到具有膜結構的茶托樣納米粒子才能算是看到了外泌體。本司采取通過透射電鏡確定外泌體大小。

二、實驗流程

1. 外泌體戊二醛固定。

2. 清洗：用1mL PBS清洗3次，每次靜置15min。

3. e酸固定：加入0.5 mL 2%e酸溶液 4度固定2h。

4. 清洗：用1mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。

5. 脫水：用50%、70%、80%、90%乙醇各1mL梯度脫水分別靜置15min，再用1mL 100%乙醇脫水2次，每次20min。

6. 置換：用1mL丙酮置換2次，每次靜置15min。

7. 浸漬。

8. 包埋：將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中。

9. 聚合：將包埋板置于65℃條件下聚合48h。

10. 染色：醋酸雙氧鈾染色 10min后清洗；醋酸鉛染色 10min后清洗。

11. 上機檢測。

12. 提供實驗報告。

三、服務說明及結果

1. 客戶提供：外泌體（30 μl）或由我司分離得到外泌體。

2. 公司提供：基本實驗步驟、圖片、數據分析結果。

3. 實驗周期：10個工作日。