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小鼠原代海馬神經元細胞的分離培養方法

來源:鏡像綺點(上海)細胞技術有限公司   2019年06月05日 15:20  

海馬體主要負責記憶和學習,日常生活中的短期記憶都儲存在海馬體中。神經元是構成神經系統結構和功能的基本單位。神經元具有長突起,由細胞體和細胞突起構成。

       小鼠海馬神經元細胞的組織來源于實驗小鼠的正常腦組織,因為海馬神經元細胞類似于干細胞屬于高分度分化的細胞特性,具有不能傳代,不能增殖等特點,所有收到細胞后盡快使用。

       1.試驗所需儀器設備及試劑

       (1)儀器

        生物安全柜

        CO2細胞培養箱

        熒光倒置顯微鏡

        高速冷凍離心機

        電熱恒溫鼓風干燥箱

       (2)試劑耗材

         T25細胞培養瓶

         血球計數板

         細胞培養孔板

         紅細胞裂解液

         神經元*培養基

         0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)

         多聚甲醛(PFA)

         DAPI

         Triton X-100

         山羊血清

         NSE

         Goat anti-Rabbit lgG(H+L)

         Cross-Adsorbed Secondary antibody,Alexa Fluor 594

         Fluoromount-G熒光封片劑

       2.分離培養方法

         1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡,

         2) 在冰浴的PBS中分離海馬,PBS洗滌3次,剪碎,

         3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型膠原酶37℃水浴振蕩消化30min,

         4) 用FBS終止消化,輕輕吹打,

         5) 過100 μm 濾網,

         6) 收集濾液,300 g離心5 min,

         7) 用*培養基重懸沉淀,鋪瓶。

        3.免疫熒光

        3.1.實驗步驟 

      (1)細胞爬片

        取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培養基1mL,加入細胞0.02million個/孔。置培養箱2h或過夜。

      (2)固定

        細胞爬片后,吸出培養基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS,放4℃過夜。

      (3)破膜封閉

        將玻片除去水分,置于培養皿支撐物上,

        玻璃片封閉液配置:0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合,再加10% 血清,

        取50uL破膜封閉液滴于防水膜上,將玻片上有細胞的一面蓋上2h。

      (4)一抗孵育

        一抗配制:抗體與PBS 1:100(200)稀釋

        破膜封閉后,取50uL一抗于防水膜上(濕盒中),將玻片(有細胞的一面)蓋上置于4℃(多可放置一周)

      (5)二抗孵育

       室溫避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。

     (6)包埋

       玻片上各滴1滴Fluoromount-G,將有細胞的一面蓋上。

       鑒定細胞為P1代細胞

       3.2.檢測結果 

     (1)細胞免疫熒光鑒定照片

       陰性

                 

                           100X-DAPI                                             100X-Fluorescence

       NSE

     

                             100X-DAPI                                          100X-Fluorescence

       (2)檢驗基本情況:

        經免疫熒光鑒定,該細胞純度達到90%以上。

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