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瓊脂糖凝膠電泳的原理及實驗過程

來源:上海勇諾生物科技有限公司   2019年03月06日 10:09  

實驗原理
    瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定 DNA、RNA 分子混合物,以瓊脂凝膠作為支持物,利用 DNA 分子在電場中時的電荷效應和分子篩效應,達到分離混合物的目的。DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負電,在電場中由陰極向陽極運動。在一定的電場強度下,忽略DNA分子攜帶的電荷,DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與相對分子量成反比。
    不同構型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環形 DNA 分子樣品,其中有三種構型的分子:超螺旋分子(cccDNA)、開環分子(ocDNA)、和線形 DNA 分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA>IDNA>ocDNA。
    核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質。瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子;聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺(Acr)在 N,N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨(AP)的催化下聚合形成長鏈,并通過交聯劑 N,N′-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)交叉連接而成。瓊脂糖凝膠適合分離200bp至近50kb的DNA片段,而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段(5bp-500bp)的分離效果很好,且分辯力*。選擇不同濃度的凝膠,可以分離丌同大小范圍的 DNA 分子。電場強度愈大,帶電顆粒的運動赹快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小,所以電泳時一般采用低電壓,不超過 6V/cm。而對于大片段電泳,可以選擇 0.5-1.0V/cm 電泳過夜。如果選擇高電壓電泳,可使用聚丙烯酰胺凝膠。
    核酸電泳常采用 TAE、TBE、TPE 三種緩沖系統。TAE 價格低廉,但緩沖能力低。TPE 在進行 DNA 回收時,會使 DNA 污染磷酸鹽,影響后續反應。所以綜合考慮,多采用 TBE 緩沖液。
    核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(EB)。溴化乙錠是一種扁平分子,可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射 BE-DNA 復合物時,通過發光指示核酸的位置。由于EB有較強的揮發性和毒性,現在大多選擇EB替代品進行試驗,比較常用的有gelred,goldview,ybr-green等,但是整體效果都若于傳統的EB。
材料、試劑及器具
1、材料
合適的Marker(分子量標準);DNA 樣品
2、試劑
加樣緩沖液(6x或10x);瓊脂糖;溴化乙錠(EB)。
3、器具
(1)電泳系統:電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
(2)凝膠成像系統或紫外透射儀。
實驗過程
1、按所分離的 DNA 分子的大小范圍,選擇合適的比例的凝膠,稱取適量的瓊脂粉,放到一錐形瓶中,加入適量的 TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至瓊脂粉*溶化,溶液透明。稍搖勻,得膠液。待膠液卻至 60℃左右,在膠液內加入適量的比例的溴化乙錠液。
2、水平放置膠槽,在一端插好梳子,在槽內緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液,使之形成均勻水平的膠面。
3、待膠凝固后,小心拔起梳子,使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
4、在槽內加入TBE電泳緩沖液,至液面覆蓋過膠面。
5、把待檢樣品,按合適比例與加樣緩沖液混勻,用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
6、接通電泳儀和電泳槽,并接通電源,調節合適電壓,穩壓輸出,開始電泳。
7、觀察溴酚蘭的帶(藍色)的位置。當其移動至約凝膠長2/3處時,可停止電泳。
8、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜,趕去氣泡平鋪,然后把凝膠放在上面。關上樣品室外門,打開紫外燈(360nm 或 254nm),通過觀察孔進行觀察。
注意事項
1、電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性、強致癌性物質,務必小心,勿沾染于衣物、
皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門電泳區域操作,戴一次性手套,并及時更換。
2、預先加入EB 時可能使 DNA 的運動速度下降15%左右,且不同構型的 DNA 的影響程度不同。所以為取得較真實的電泳結果可以在電泳結束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,若凝膠放置一段時間后才觀察,即使原來膠內或樣品已加 EB,建議選擇EB溶液浸泡染色。
3、加樣進膠時不要形成氣泡,需在凝膠液未凝固之前及時**,否則,需重新制膠。
4、電泳時溴酚蘭在瓊脂糖凝膠中的運動速度可以用于參考電泳速度,已實際電泳條帶運動速度為準。
常見問題分析
 

常見問題

原因

對策

DNA條帶模糊

DNA降解

實驗過程避免核酸酶污染

電泳緩沖液陳舊

電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低,PH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。TBE建議使用10次就更換緩沖液

所用電泳條件不合適

電泳時電壓不應超過6V/CM,溫度<30℃,巨大DNA鏈電泳,溫度應<15℃,核查所用電泳緩沖液的緩沖能力,注意經常更換

DNA上樣量過多

減少凝膠中DNA上樣量

DNA含鹽過高

電泳前通過乙醇沉淀去除多余鹽分

有蛋白污染

電泳前酚抽提去除蛋白

DNA變性

電泳前勿加熱,用TE緩沖液稀釋DNA

出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往PCR體系需要優化,PCR程序需要摸索。

其對策有:調整PCR體系和PCR程序,摸索出合適的條件。

不規則DNA帶遷移

電泳條件不合適

電泳時電壓不應超過6V/CM,溫度<30℃,巨大DNA鏈電泳,溫度應<15℃,核查所用電泳緩沖液的緩沖能力,注意經常更換

DNA變性

電泳前勿加熱,用TE緩沖液稀釋DNA

帶弱或無DNA帶

DNA上樣量不夠

增加DNA上樣量,聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高,上樣量可適當降低

DNA降解

實驗過程避免核酸酶污染

DNA跑出凝膠

縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度

EB染色的DNA,所用光源不合適

應用短波長(254nm)的紫外光源

DNA帶缺失

DNA跑出凝膠

縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度

分子大小相近的DNA帶不易分辨

增加電泳時間,核準正確凝膠濃度

DNA變性

電泳前勿加熱,用20mM Nacl 緩沖液稀釋DNA

DNA鏈巨大,常規凝膠電泳不合適

在脈沖凝膠電泳上分析

電泳時Ladder扭曲

配膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時配置

同時配置,電泳緩沖液高出液面1-2mm即可

電泳時電壓過高

電泳時電壓不應超過6V/CM

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