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線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)

來(lái)源:上海研謹(jǐn)生物科技有限公司   2019年02月26日 17:29  

貨號(hào)YJ1219                                         規(guī)格:100管/48樣

線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱(chēng)F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過(guò)程水解ATP。此外,復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理:

復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過(guò)測(cè)定Pi增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

試劑一:100mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:80mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:2mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑四:粉劑×1 支,-20℃保存;臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五:8mL×1 瓶,4℃保存;

試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入4mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存。

定磷試劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染(請(qǐng)根據(jù)需要,用多少配多少)。

注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿 600g,4℃離心 5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ(此步可選

做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟:

  • 酶促反應(yīng)(在EP管中加入下列試劑)

試劑名稱(chēng)(μL)

對(duì)照管

測(cè)定管

試劑四

20

20

試劑五

80

80

樣本

 

100

混勻, 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴 30min

試劑六

40

40

樣本

100

 

混勻,4000g,25℃離心 10min,取上清液

  • 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑)

上清液

30

30

定磷試劑

170

170

混勻,室溫靜置10min后,在660nm處讀取A測(cè)定管和A對(duì)照管,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y為A 值。

1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L; V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y 為A 值。

1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L;V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

 

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