梯度洗脫是指在同一個分析周期中隨著時間的變化按一定程序梯度性地改變洗脫液的比例(濃度配比、成分、離子強度、溶液極性等)或pH，以期將層析柱上不同的組分洗脫出來的方法。從而可以使一個復雜樣品中性質（極性）差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。梯度洗脫一般分為二元高壓梯度，二元低壓梯度和四元低壓梯度；二元高壓梯度需要兩臺高壓泵，二元低壓梯度和四元低壓梯度都是只需要一臺高壓泵和一個比列閥。

梯度洗脫的原理

具體地講，當樣品隨梯度起點的流動相進入色譜柱入口時，由于起點流動相中弱洗脫溶劑A含量較高，強洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適中)和化合物C2(保留較強)因分配系數(k值)較高而滯留于色譜柱入口附近，幾乎未移動。一段時間后，B增加到一定數值，C1的k值達到足夠小(比如小于10)，其在柱中的移動速率明顯增大，并且隨著B的增加，其移動速率愈加快速，直到tC1時流出色譜柱，被檢測器檢測到并被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時的保留時間長很多，但C1的的平均k值卻很小，因而色譜峰并未展寬，靈敏度仍處于較高水平。B持續增加，在隨后的某個時間點，C2的k值也降到10以下，C2的移動速率也開始變快，以與C1類似的方式于tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣很小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處于較高水平。

流動相的梯度變化即流動相極性、PH值等的梯度變化，即洗脫能力成梯度變化。

洗脫要求

1.洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使各峰*或基本分離；

2.梯度的上限（強洗脫溶劑的比例）要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。

3.梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。