豬瘟檢測,主要監測手段是實時熒光定量PCR儀,大致流程步驟為:樣品研磨(制備樣品)----磁珠提取(提取DNA,RNA)----結合試劑盒上實時熒光定量PCR儀檢測。而在樣品研磨過程中采用新銳精儀組織研磨儀GD200、GD300、GD16都可以很好運用到這一環節中來,下面以GD16為例:
1 器材和設備
1.1組織研磨儀GD16
1.2離心管
1.3 高速臺式冷凍離心機:大離心力12000g以上
1.4冰箱
1.5 熒光PCR檢測儀
1.6 微量移液器和吸頭
2 樣品的采集
2.1采樣注意事項
采樣及樣品前處理過程中應戴一次性手套,樣本不得交叉污染。
2.2采樣工具
扁桃體采樣器:鼻捻子、開口器和采樣搶。使用前均應用3%氫氧化鈉溶液浸泡5Min~10Min,經清水沖洗。
滅菌牙簽和0.5ml或1.5ml離心管經(121±2)℃,高壓滅菌15Min;剪、鑷經160℃干烤2h。
2.3 采樣方法
2.3.1 活體樣品
固定活豬的上唇,用開口器打開口腔,用采樣搶采取扁桃體樣品,用滅菌牙簽挑至0.5ml或1.5ml離心管并作標記,編號送實驗室。取待檢樣品,按1:5倍體積加入DEPC水,于研缽或組織勻漿器中充分研磨,3000g離心15min,取上清液轉入離心管中編號備用。
2.3.2 內臟樣品
采取病死豬各種臟器(淋巴結、胰臟、脾臟、回腸、肝臟和腎臟)裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器,編號,送實驗室。取50mg~100mg待檢樣品,按1:5倍體積加入DEPC水,于研缽或組織勻漿器中充分研磨,3000g離心15min,取上清液轉入離心管中編號備用。
2.3.3 4%EDTA抗凝血
用無菌注射器直接全血,注入含1/10 4%EDTA溶液的無菌容器中,充分混勻后編號備用。
2.3.4 排泄物
挑取少許糞便樣本于離心管中,加入適量生理鹽水,振蕩混勻,室溫3000g,離心管15min,取上清液轉入離心管中編號備用。其余液體排泄物直接轉入離心管編號備用。
2.3.5 細胞培養物
細胞培養物凍融3次,轉入離心管中編號備用。
2.3.6 存放與運送
采集或處理的樣品在2℃~8℃條件下保存應不超過24h;若需長期保存,應放置-70℃冰箱,但應避免反復凍融(凍融不超過3次)。采集的樣品密封后,采用保溫壺或保溫桶加冰密封,在6h~8h之內運送到實驗室。按照《獸醫實驗室生物安全技術管理規范》進行樣品的生物安全標識。
3.實時熒光RT-PCR檢測
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