細胞血紅素氧合酶-1（HEME OXYGENASE-1）活性比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞血紅素氧合酶-1（HEME OXYGENASE-1）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用特異性抑制劑，通過NADPH生成系統和血紅素氧合酶反應系統中，血紅素被水解為膽綠素后其吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）或純化微粒體樣品血紅素氧合酶-1的特異活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

血紅素氧合酶（heme oxygenase；HO；EC1.14.99.3）是一種催化血紅素分解代謝的微粒體內限速酶，即通過氧化降解游離血紅素為一氧化碳、自由鐵和膽綠素（biliverdin）或結合血紅素產物膽綠素蛋白（verdoglobin）。血紅素氧合酶存在于體內的所有細胞中，在脾臟中活性高，旨在處理衰老的紅細胞。血紅素氧合酶有3種同工酶：I型為誘導型，又歸類為熱休克蛋白32K（heat shock protein 32K），受到氧化應激、一氧化氮、缺氧、重金屬、細胞因子等激發；II型為結構型，維持體內內平衡，在腦組織、睪丸、血管上皮細胞高度表達；III型為結構型，具有氧感受作用，不具有催化活性。其中誘導型血紅素氧合酶（血紅素氧合酶-1；HO-1）是機體重要的內源性保護物質之一，廣泛參與組織細胞的抗氧化應激損傷，是在細胞受損維持其氧化和抗氧化動態平衡的關鍵因素，成為炎性反應的調節靶標。此外，淤青的形成便是血紅素氧合酶的作用，由紅色的血紅素轉變為綠色的膽綠素，后變成黃色的膽紅素（bilirubin）。基于底物血紅素（heme），由NADPH生成系統（NADPH generating system）的參與，在血紅素氧合酶-1選擇性敏感抑制劑咪唑-二氧戊環化合物（imidazole-dioxolane compound）QC-13[(2R,4R)-2-[2-(4-chlorophenyl)ethyl]- 2-[(1H-imidazol-1-yl) methyl]-4-methyl -1,3-dioxolane hydrochloride]存在與否的情況下，由血紅素氧合酶催化分解作用下，產生一氧化碳、自由鐵和膽綠素（biliverdin），由此出現吸光峰值的變化（464nm和530nm波長），來定量測定血紅素氧合酶-1的特異活性。其反應系統為：

glucose-6-phosphate dehydrogenase

D-glucose-6-phosphate   +   NADP⁺   →   NADPH   +   6-Phospho-D-gluconate

heme oxygenase-1

Heme  + 2 NADPH  +  O₂  →  biliverdin  +  Fe²⁺  +  CO  +  2 NADP⁺   +  H₂O

                                QC-13

產品內容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  70毫升

 緩沖液（Reagent C）  40毫升

 反應液（Reagent D）   2毫升

 底物液（Reagent E）     2毫升

 陰性液（Reagent F）     1毫升

 終止液（Reagent G）    40毫升

 專性液（Reagent H）     1毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存 反應液（Reagent D）、 底物液（Reagent E）和 專性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照； 終止液（Reagent G）具有腐蝕性，注意安全；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2毫升離心管：用于樣品反應的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

恒溫水槽：用于孵育反應

微型臺式離心機：用于樣品操作

超速離心機：用于樣品操作

渦旋震蕩儀：用于混勻反應

比色皿：用于反應和比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升預冷的 裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約40下）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為9000g
• 移取上清液到2個新的1.5毫升離心管
• 放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 分別加入200微升 裂解液（Reagent B）
• 合并到1個1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－ MB30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
• 設定好雙波長分光光度儀（溫度為37℃）：波長分別為464nm和530nm，并置零
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 樣品總活性測定

• 準備2個2毫升離心管，標記為背景管和樣品管
• 分別移取850微升 緩沖液（Reagent C）
• 分別加入50微升 反應液（Reagent D）
• 分別加入50微升 底物液（Reagent E）
• 加入50微升 陰性液（Reagent F）到背景管
• 加入50微升待測樣品（100微克微粒體蛋白或500微克細胞裂解萃取液蛋白）到樣品管（注意：樣品須清澈）
• 蓋上蓋子，上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 分別加入1毫升 終止液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
• 分別移取1毫升綠色液相液體到比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測
• 記錄實際吸光讀數：吸光讀數464nm—吸光讀數530nm

• 樣品非特異活性測定

檢測開始前，分別加入50微升 專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：（100微克微粒體蛋白或500微克細胞裂解萃取液蛋白）到1.5毫升離心管，混勻后，放進30℃培養箱里孵育30分鐘。然后繼續下列操作。

• 準備2個2毫升離心管，標記為背景管和樣品管
• 分別移取800微升 緩沖液（Reagent C）
• 分別加入50微升 反應液（Reagent D）
• 分別加入50微升 底物液（Reagent E）
• 加入50微升 陰性液（Reagent F）和 專性液（Reagent H）到背景管
• 加入100微升上述預處理的待測樣品到樣品管
• 蓋上蓋子，上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 分別加入1毫升 終止液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
• 分別移取1毫升綠色液相液體到比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測
• 記錄實際吸光讀數：吸光讀數464nm—吸光讀數530nm

五、計算樣品活性

• 樣品總活性和非特異活性計算

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 40000（微摩爾吸光系數）X 1（反應時間；小時）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝納摩爾膽綠素/小時

2）樣品特異活性計算

特異活性＝總活性－非特異活性

注意事項

• 本產品為20次（比色皿）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
•  終止液（Reagent G）具有腐蝕性，注意操作安全
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 如果酶活性過低，可以增加反應時間至2小時
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 可以使用血紅素氧合酶誘導劑硫酸銅（EC50=0.24毫摩爾）作為誘導劑對照或陽性對照
• 建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為100微克/50微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其總蛋白濃度為250至500微克/50微升（本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒 MB30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 血紅素氧合酶-1單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每小時內能夠產生1納摩爾膽綠素所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列血紅素氧合酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感