血液氧化應激活性氧光澤精化學發光法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 血液氧化應激活性氧（ROS）光澤精化學發光法定量檢測試劑是一種旨在通過使用自由基探針光澤精，捕獲體液中的活性氧族，使發光物氧化降解并發光，在化學發光儀（Luminometer）的幫助下定量檢測樣品中活性氧族（超氧自由基陰離子）的生成和數量的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體血液樣品包括血漿、血清等活性氧族的檢測。 產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩定，檢測敏感。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡，甚而導致諸如男性不育、冠心病、風濕性關節炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。光澤精（lucigenin），又稱硝酸雙-N-甲基吖啶翁（bis-N-methylacridinium nitrate），是一種帶正電荷的發光劑，單價還原后生成光澤精自由基，再與超氧自由基陰離子反應生成不穩定的中間物光澤精二惡二酮，由此分解成電激發狀態（N－甲基丫啶酮），通過釋放光子，回復到基態。光澤精作為探針，可以特異性檢測體液中超氧自由基陰離子，其發光強度與超氧自由基陰離子水平成正相關。 

產品內容

 清理液（Reagent A）      20毫升

 發光液（Reagent B）       1毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存 發光液（Reagent B） 在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

測試管或黑色96孔板：用于發光檢測用的容器

化學發光儀：用于檢測化學發光

實驗步驟

• 樣品預處理

選擇一：血漿樣品

• 準備好抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）放進－70℃冰箱里保存
• 放進37℃培養箱里備用（1小時內）

選擇二：血清樣品

• 準備好不含抗凝劑的儲存管
• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）放進－70℃冰箱里保存
• 放進37℃培養箱里備用（1小時內）

• 測讀

測讀開始前，打開化學發光儀，設定儀器內溫度為37℃預熱和整合測讀10秒或15分鐘；然后關掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴格置于暗室里。然后進行下列操作。

• 準備好測試管，做好標記：陰性對照、樣品本底和樣品活性
• 移取400微升 清理液（Reagent A）到陰性對照測試管
• 移取400微升上述預處理的血液樣品到樣品本底測試管
• 移取400微升上述預處理的血液樣品液到樣品活性測試管
• 分別加入10微升 發光液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管
• 輕輕渦旋混勻
• 即刻放進37℃化學發光儀里測讀
• 整合測讀10秒，獲得相對發光單位（relative light unit；RLU）
• 或者整合測讀15分鐘，獲得光電子讀數：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液體閃爍儀替代）
• 計算ROS水平：

（樣品活性－樣品本底） ÷ 0.4（毫升；樣品容量） ＝相對發光單位（RLU） / 毫升＝相對發光單位（RLU）/【（N）X 10⁶ 細胞】＝X 10⁶ CPM/毫升＝X 10⁶ CPM/【（N）X 10⁶ 細胞】

注意事項

• 本產品為50次操作
• 如果測定體系變化，則試劑用量相應變化
• 操作時，須戴手套
• 測試前，血液樣品須新鮮收集，1小時內為*
• 樣品制備后即刻測讀，不宜過夜保存
• 必要時，例如活性氧族過低，可以濃縮樣品處理
• 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
• 如果是注射式化學發光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學發光儀注射（injector）管道
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感