免疫組化雙染試劑盒組成:
即用型過氧化酶阻斷劑 6ml
即用型正常動物非免疫血清 12ml
即用型生物素標記的第二抗體 12ml
即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶 6ml
即用型堿性磷酸酶顯色液 6ml
即用型雙染增強液 6ml
即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶6ml
過氧化酶底物緩沖液 1.5ml
過氧化酶底物 1.5ml
過氧化酶染色液 1.5ml
即用型蘇木素復染液 6ml
即用型水性封片劑 6ml
免疫組化雙染試劑盒的實驗流程:
脫蠟和水化
方法同SP法。
抗體的染色
1.將切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鮮配制)中10 min,PBS沖洗3 min×3次;
2.加100 ul(2滴)血清封閉溶液到切片上,室溫孵育10 min,倒掉(不能沖洗);
3.加入一抗(按照說明書推薦濃度和孵育條件);
4.使用含有0.05%吐溫20的PBS( TPBS),沖洗5 min×3次;
5.加入100 ul(2滴)生物素化的二抗,室溫孵育10 min;
6.用TPBS沖洗5 min×3次;
7.加入100 ul(2滴)鏈霉親和素-AP的二抗,室溫孵育10 min;
8.用TPBS沖洗5 min×3次;
9.準備底物溶液:將1滴試劑4A和4B加入到1 ml去離子水中,充分混勻。再加入1滴試劑4C,充分混勻;
10.加100 ul(2滴)配好的AP底物溶液,室溫孵育;
11.使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應。
第二抗體的染色
12.加100 ul(2滴)雙染增強劑,孵育;
13.用TPBS沖洗3 min×3次;
14.加100 ul(2滴)血清封閉溶液到切片上,室溫孵育10 min,倒掉(不能沖洗);
15.加入稀釋好的一抗(按照說明推薦濃度和孵育條件);
16.用TPBS沖洗5 min×3次;
17.加入100 ul(2滴)生物素化的二抗,室溫孵育10 min;
18.用TPBS沖洗5 min×3次;
19.加入100 ul(2滴)鏈霉親和素-HRP的二抗,室溫孵育10 min;
20.用TPBS沖洗5 min×3次;
21. 準備底物溶液:將1滴試劑6A和6B加入到1 ml去離子水中,充分混勻。再加入1滴試劑6C,充分混勻;
22、 加100 ul(2滴)配好的HRP底物溶液,室溫孵育;
23.使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應;
24.使用復染試劑染色(根據需要選擇);
25.封片劑封片,顯微鏡觀察并拍照。
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